子痫前期胎盘组织差异性甲基化基因筛选及TNFAIP8在子痫前期胎盘及外周血的表达

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一章 子痫前期胎盘组织甲基化情况及差异性甲基化候选基因生物学功能分析
　　目的：
　　本课题采用病例对照研究，分析其可能参与的生物学功能及信号通路，聚焦可能与母胎界面相关的若干基因位点，旨在进一步寻找参与子痫前期发生发展相关的候选基因以备后续验证。
　　方法：
　　1、实验分组:选取年龄、产次及孕周相匹配的早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组孕妇各3例进行甲基化芯片检测。
　　2、胎盘组织采集:分娩后30分钟内从胎盘中选取4个1cm3大小标本切成细条，用无菌PBS缓冲液清洗干净擦干，置于冻存管，-80℃冰箱保存。
　　3、差异性甲基化基因定位及生物学功能聚类分析:利用Pubmed或GALAXY数据库识别差异甲基化位点在基因组中的位置;利用MEME数据库识别与CpG岛甲基化周围结合的基序;采用DAVID数据库对差异甲基化位点进行生物学功能聚类分析;Fischer's exact test比较聚类分析后各信号通路的相对重要性。
　　结果：
　　1、甲基化芯片质控结果显示，探针符合质控标准，实验体系稳定。荧光信号强度强，均一;背景值低，亚硫酸盐转换效率高。
　　2、早发型子痫前期与对照组、晚发型子痫前期和对照组胎盘对比共发现23308和18318个差异甲基化位点。同时满足差异有统计学意义及探针落在TSS或5' UTR区域的位点分别为有999个和527个，交集有95个。
　　3、子痫前期和正常分娩胎盘对比的差异性甲基化基因主要与以下生物学功能调控相关:多细胞生物过程、生长发育过程、多细胞生物发育过程、解剖结构发育、系统发育。
　　结论：
　　利用全基因组DNA甲基化芯片成功检测了子痫前期与正常分娩的胎盘组织，结果显示两者确实存在某些基因位点的甲基化状态改变。对芯片结果进行生物学信息分析发现，差异显著性基因涉及多条信息通路，主要和细胞生物过程、各系统及解剖结构发育相关。由于涉及的基因数量庞大，可选择某些位点进一步进行验证，为进一步研究子痫前期病理生理的变化规律，探讨有效诊治方法奠定基础。
　　第二章 与免疫相关的差异性甲基化候选基因选择及焦磷酸测序验证
　　目的：
　　采用焦磷酸测序技术，通过该技术验证筛选的差异性甲基化基因，比较早发型子痫前期、晚发型子痫前期和正常孕妇胎盘组织中该位点的甲基化差异，为后续该基因位点的蛋白表达及其与子痫发病的关联研究提供更多的证据。
　　方法：
　　1、实验分组:选择2013年3月至2014年5月在福建省立医院产科分娩的46例孕妇，早发型子痫前期组16例，晚发型子痫前期组12例，正常足月分娩孕妇18例。
　　2、确定焦磷酸测序目标基因:同时满足两个条件:甲基化差异矫正后有统计学意义（P＜0.05，M＞1.0或M＜-1.0），限定探针分布在转录起始位点或5'UTR区域的位点。同时，该基因应为编码蛋白质的基因，在胎盘和外周血均有表达，且其基础甲基化水平较高。
　　3、焦磷酸测序:设计引物，每个样本各取1～2μg用EpiTect Plus DNA Bisulfite Kit甲基化转化试剂盒进行转化。以转化后的DNA样本做模板进行PCR，取PCR产物在PyroMark Q24实时定量焦磷酸系列分析仪上进行测定。
　　结果：
　　1、确定验证的目标基因:排除假基因，选择交集中两个基因之一KIR2DL4。在早发型和对照组比较差异显著的基因中，由于TNFAIP8在胎盘和淋巴细胞上表达水平较高，且与维持细胞稳态和自身免疫调节功能密切相关，也予入选。
　　2、三组年龄、孕次等无统计学差异，胎盘组织DNA质控评价合格。
　　3、TNFAIP8两个位点的甲基化程度为10％左右。在TNFAIP8位点1中，早发型子痫前期组和其他两组相比甲基化程度的差异均有统计学意义(P＜0.03);而晚发型子痫前期组和对照组相比差异无统计学意义(P＞0.05)。三组间TNFAIP8位点2的甲基化程度差异无统计学意义(P＞0.05)。
　　结论：
　　选择待验证的基因位点除了要考虑基因类型、基础甲基化水平，还必须考虑该基因表达的器官及可能参与子痫前期发展的途径，否则会增加测序验证的风险，浪费不必要的经济资源。早发型子痫前期相对于晚发型子痫前期和正常分娩胎盘组织，TNFAIP8基因甲基化水平明显降低甚至未发生甲基化，而KIR2DL4基因的甲基化差异则无统计学差异。
　　第三章 TNFAIP8在子痫前期及正常分娩胎盘组织表达情况的差异
　　目的：
　　本研究旨在探讨TNFAIP8因子在胎盘组织中的定位定量表达情况，及与该基因在前期甲基化情况的关联，有助于阐明子痫前期病理性损伤的机制。
　　方法：
　　1、实验分组:选择2013年3月至2014年8月在福建省立医院产科分娩的64例孕妇，早发型子痫前期组23例，晚发型子痫前期组16例，正常足月分娩孕妇25例。
　　2、胎盘组织采集:分娩后30分钟内从胎盘中选取4个1 cm3大小标本切成细条，用无菌PBS缓冲液清洗干净擦干，置于冻存管，-80℃冰箱保存。
　　3、胎盘组织免疫组化:取尽可能新鲜0.5cm×0.5cm×0.1cm胎盘组织块，PBS冲洗后用4％多聚甲醛固定。包埋组织块、切片、脱蜡、入水、加入抗体、染色。选择实验组和对照组的阳性和阴性组织相、进行100×和400×的显微照相，分析图像。
　　结果：
　　1、胎盘免疫组化结果:胎盘绒毛结构外围的合体滋养层细胞，绒毛内部血管内皮细胞TNFAIP8表达阳性。早发型子痫前期在阳性细胞数、阳性细胞显色强度及IHS评分方面，与晚发型子痫前期和正常胎盘组织相比明显增加。
　　2、胎盘组织荧光定量RT-PCR结果:三组间胎盘TNFAIP8mRNA相对表达量差异，两两相比均有统计学差异(P=0.000)，早发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较晚发型子痫前期及对照组增多，晚发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较对照组增多(P=0.000)。
　　3、胎盘组织Western Blot结果:三组TNFAIP8电泳条带显色按照早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组顺序逐渐递减。三组胎盘TNFAIP8蛋白表达量差异两两相比均有统计学差异(P=0.000)，早发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较晚发型子痫前期及对照组增多(P=0.000)，晚发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较对照组增多(P=0.000)。
　　结论：
　　根据前期胎盘组织甲基化芯片和焦磷酸测序的验证结果，TNFAIP8基因明显低甲基化甚至未甲基化，按照一般规律TNFAIP8的转录及表达应该明显增高。本章验证了该推测，在胎盘组织中，早发型子痫前期的TNFAIP8表达明显高于晚发型子痫前期及正常孕妇，而晚发型子痫前期的TNFAIP8表达也明显高于正常孕妇。因此推测早发型子痫前期和晚发型子痫前期的TNFAIP8基因在胎盘有类似的甲基化和蛋白表达模式。
　　第四章 TNFAIP8在子痫前期和正常分娩孕妇外周血表达情况的差异
　　目的：
　　本章拟通过观察外周血淋巴细胞TNFAIP8的表达变化规律，探讨TNFAIP8作为血液标志物的可行性。
　　方法：
　　1、实验分组:选择2013年3月至2014年8月在福建省立医院产科分娩的64例孕妇，早发型子痫前期组23例，晚发型子痫前期组16例，正常足月分娩孕妇25例。
　　2、外周血采集:子痫前期孕妇及正常足月妊娠孕妇入院后抽取肘静脉血液3ml×2管，置于EDTA抗凝管中，-80℃冰箱保存。
　　3、外周血荧光定量RT-PCR:实验步骤同第三章。
　　4、外周血淋巴细胞蛋白Western Blot:提取外周血液淋巴细胞总蛋白，加入裂解液用枪吹打数下，使裂解液充分接触细胞将细胞裂解。悬浮细胞，收集培养细胞，裂解物经离心3～5分钟，取上清，即可进行后续实验。其余实验步骤同第三章。
　　结果：
　　1、外周血荧光定量RT-PCR结果:实时扩增及产物溶解曲线图显示目的基因和内参基因的扩增效率一致，扩增产物单一。三组间外周血淋巴细胞TNFAIP8mRNA相对表达量差异两两相比均有统计学意义(P=0.000)，早发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较晚发型子痫前期及对照组增多有统计学意义(P=0.000)，晚发型子痫前期的TNFAIP8mRNA表达量较对照组增多有统计学意义（P=0.000）。
　　2、外周血淋巴细胞蛋白Western Blot结果:三组外周血TNFAIP8电泳条带显色按照早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组顺序逐渐递减。三组胎盘TNFAIP8蛋白表达量差异两两相比均有统计学差异（P=0.000）。早发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较晚发型子痫前期及对照组增多有统计学意义(P=0.000)，晚发型子痫前期的TNFAIP8蛋白表达量较对照组增多有统计学意义（P=0.000）。
　　结论：
　　外周血淋巴细胞TNFAIP8的表达情况与胎盘组织相似，早发型子痫前期、晚发型子痫前期、对照组三组的TNFAIP8转录和蛋白表达量按照该顺序递减且两两比较差异显著。对外周血的深入探索研究有望为子痫前期临床早期诊断预测、判断病情的严重程度提供理论依据。

目录

摘要

前言

第一章 子痫前期胎盘组织甲基化情况及差异性甲基化候选基因生物学功能分析

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第二章 与免疫相关的差异性甲基化候选基因选择及焦磷酸测序验证

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第三章 TNFAIP8在子痫前期及正常分娩胎盘组织表达情况的差异

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

第四章 TNFAIP8在子痫前期和正常分娩孕妇外周血表达情况的差异

第一节 材料

第二节 方法

第三节 结果

第四节 讨论

结论

参考文献

综述 DNA甲基化在子痫前期发病机制中的研究进展及候选基因的选择

中英文缩略词

成果

致谢

声明

统计学证明