FOXD3通过调控miR-214及其靶基因参与结直肠癌转移及放疗抵抗的分子机制

摘要

目的：
　　本课题旨在揭示miR-214新的表达调控机制，阐明FOXD3/miR-214/靶基因轴在结直肠癌发生发展中的作用机制，为肿瘤诊治提供新的思路及治疗靶点。
　　方法：
　　1.结直肠癌组织和细胞中异常表达miRNAs筛选及验证
　　利用miRNA芯片初步筛选出在结直肠癌组织和细胞中差异表达明显且与转移和放疗相关的miR-214，利用荧光定量PCR验证miR-214在结直肠癌组织和细胞中表达情况。
　　2.miR-214靶基因的预测和鉴定
　　以miR-214为关键词，使用miRanda、TargetScan、Pictar和RNAhybrid数据库对miR-214靶基因进行预测，挑选交集多且预测值高并通过查阅文献寻找转移和放疗相关靶基因MED19和CDC25A，采用双荧光素酶报告基因进行确定，并利用荧光定量PCR和Western blot检测miR-214及其靶基因在六株结直肠癌细胞中的表达并进行相关性分析。
　　3.miR-214对结直肠癌细胞生物学行为的影响
　　(1)设计并构建miR-214慢病毒表达载体，进行慢病毒包装，感染SW480和HCT116细胞，经流式细胞仪分选稳定表达的细胞株，利用荧光定量PCR验证miR-214的表达;
　　(2)将miR-214慢病毒表达载体和不含3'UTR的两个靶基因(MED19和CDC25A)编码区表达慢病毒载体共转染至SW480和HCT116细胞中，构建稳定表达的细胞株，利用Western blot检测MED19和CDC25A的表达变化;
　　(3)采用CCK-8、平板克隆、体外侵袭、Western blot及细胞免疫荧光实验，检测miR-214表达载体及miR-214和靶基因(不含3'UTR)共表达载体转染后对结直肠癌细胞株SW480和HCT116体外增殖、侵袭及放疗耐受的影响;
　　结果：
　　1.结直肠癌转移及放疗相关miRNA的筛选及鉴定
　　(1)送检3张miRNA芯片结果表明，与正常结直肠粘膜组相比，在结直肠癌组及远处转移组中共筛选出42个表达均下调的miRNA，其中包括miR-214。本课题组对结直肠癌SW837细胞8Gy放疗前后送检miRNA芯片，结果表明，与放疗前比，放疗后SW837细胞中miR-214表达显著降低，提示miR-214与侵袭、转移和放疗密切相关。
　　(2)利用荧光定量PCR检测30例配对新鲜结直肠癌组织中miR-214的表达，通过配对样本T检验结果显示:miR-214在结直肠癌组织中的表达显著低于正常粘膜组织(t=2.285，P＜0.001);进一步将30例结直肠癌组织分为伴远处转移组及不伴有转移组，结果表明，miR-214在伴远处转移结直肠癌组织中的表达显著低于不伴转移结直肠癌组织(t=2.175，P＜0.001)。荧光定量PCR检测miR-214在6种结直肠癌细胞株中的表达，单因素方差分析显示，miR-214在5株细胞之间的差异，具有统计学意义(F=114.632，P＜0.001)。SW480和HCT116细胞分别在0Gy、2Gy、4Gy、6Gy和8Gy剂量放疗，24小时后收集细胞，荧光定量PCR检测miR-214表达，结果表明，随着放疗剂量增加miR-214表达是逐渐降低，差异具有统计学意义(F=1029.532，P＜0.001; F=618.172，P＜0.001)。
　　2.miR-214靶基因的预测及鉴定
　　(1) miR-214转移和放疗抵抗相关靶基因的生物信息学预测
　　通过四个常用在线预测数据库和查阅文献预测与miR-214相互作用的靶基因，结果显示MED19（4个软件均预测到）与增殖和转移相关，CDC25A(2个软件预测到)与放疗相关。因此，我们假设MED19和CDC25A作为miR-214的靶基因。
　　(2)在HEK293A、SW480和HCT116细胞中，转染psiCHECKTM-2-MED19-3'UTR载体结果显示:与Mock组和MED19组比，miR-214/MED19共转染组荧光素酶活性均降低，具有统计学意义(F=15.426，P＜0.005; F=59.820，P＜0.001;F=73.500，P＜0.001)，表明miR-214能够与MED193'UTR结合，从而抑制荧光素酶的活性;转染psiCHECKTM-2-CDC25A-3'UTR载体结果显示:与Mock组和CDC25A组比，miR-214/CDC25A共转染组荧光素酶活性均降低，具有统计学意义(F=35.618，P＜0.010; F=313.848; P＜0.001; F=100.236，P＜0.001)，表明miR-214能够与CDC25A3'UTR结合，从而抑制荧光素酶的活性。
　　(3) Western blot检测MED19和CDC25A在6种结直肠癌细胞株中的表达，结果表明，MED19在HCT116、SW480、SW620、LOVO、LS174t和HT29细胞中表达逐渐降低;CDC25A在HCT116、SW480、LS174t、SW620、LOVO和HT29细胞中的表达是逐渐降低。
　　3.miR-214过表达及回复靶基因后对结直肠癌细胞生物学行为的影响
　　(1)荧光定量PCR检测SW480和HCT116细胞中miR-214组、Mock组、miR-214/MED19共转染组和miR-214/CDC25A共转染组中的miR-214表达变化，结果表明，SW480和HCT116细胞株中四组间miR-214的表达差异均具有统计学意义(F=47219.146，P＜0.001; F=17177.032，P＜0.001)。两两比较结果表明，与Mock组相比，miR-214组中miR-214表达显著增高，具有统计学意义(P＜0.001，P＜0.001)，而与miR-214组相比，miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组中miR-214表达变化不明显，差异不具有统计学意义(P=0.946，P=0.594;P=0.747，P=0.749)。结果表明miR-214转染成功，并且MED19和CDC25A重新导入后，对miR-214的表达没有明显影响。
　　(2) Western blot检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组的MED19和CDC25A蛋白表达变化，结果表明，与Mock组相比，在miR-214组中MED19和CDC25A蛋白表达明显下降，而分别重新转染MED19和CDC25A后，MED19和CDC25A蛋白表达又上升。结果表明，miR-214能下调MED19和CDC25A蛋白表达。
　　(3) CCK-8法检测SW480和HCT116细胞中Mock组、miR-214组、miR-214/MED19和miR-214/CDC25A共转染组的体外增殖能力并绘制细胞生长曲线。析因设计方差分析表明，MED19靶基因结果显示:SW480和HCT116细胞株中时间与分组之间交互效应有显著性的差异，具有统计学意义(F=52.77，P＜0.001;F=62.274，P＜0.001)，生长时间水平有显著性的差异，具有统计学意义(F=2607.833，P＜0.001;F=35.355，P＜0.001)，三组间细胞增殖能力组间有显著性的差异，具有统计学意义(F=271.281，P＜0.001;F=4.376，P＜0.001)。两两比较结果表明:SW480细胞生长时间第4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P＜0.05)，细胞增殖能力组间3天、4天、5天、6天和7天差异具有显著性（P＜0.05）。CDC25A靶基因结果显示:SW480和HCT116细胞株中时间与分组之间交互效应有显著性的差异，具有统计学意义(F=43.861，P＜0.001;F=39.225，P＜0.001)，生长时间水平有显著性的差异，具有统计学意义(F=2170.620，P＜0.001; F=1501.804，P＜0.001)，组间细胞增殖能力有显著性的差异，具有统计学意义(F=227.617，P＜0.001; F=173.087，P＜0.037)。两两比较结果显示:HCT116细胞生长时间第4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P＜0.05)，细胞增殖能力组间4天、5天、6天和7天差异具有显著性(P＜0.05)。以上结果表明，miR-214通过靶基因（MED19和CDC25A）抑制结直肠癌细胞体外增殖。
　　结论：
　　1、miR-214下调与结直肠癌转移和放疗敏感密切相关。
　　2、FOXD3/miR-214/MED19轴抑制结直肠癌增殖和侵袭转移;
　　3、miR-214通过靶基因CDC25A增强结直肠癌放疗抵抗能力。
　　本研究的创新之处:
　　1、阐明FOXD3/miR-214/MED19轴在结直肠癌侵袭转移中关键作用，为肿瘤诊治提供新的思路及治疗靶点。
　　2、提出miR-214可能在结直肠癌转移患者进行放射治疗前具有预测价值。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 结直肠癌转移与放疗相关miRNAs基因芯片的筛选及其表达验证

第一节 结直肠癌转移及放疗相关miRNAs的筛选

一、材料和方法

二、结果

第二节 miR-214在结直肠癌组织及细胞中表达验证

一、材料和方法

二、结果

三．讨论

参考文献

第二章 miR-214靶基因预测及验证

第一节 预测miR-214靶基因

一、材料和方法

二、结果

第二节 双荧光素酶报告系统检测MED19及CDC25A与miR-214相互作用

一、材料和方法

二、结果

第三节 miR-214与MED19、CDC25A在结直肠癌细胞株中的相关性分析

一、材料和方法

二、实验结果

第三章 miR-214过表达及回复靶基因对结直肠癌细胞生物学特性的影响

一、材料和方法

二、结果

三．讨论

参考文献

第四章 miR-214上游转录因子的鉴定及其功能研究

第一节 miR-214上游转录因子的预测和鉴定

一、材料和方法

二、结果

第二节 FOXD3对结直肠癌细胞生物学特性的影响

一、材料和方法

二．结果

三．讨论

参考文献

全文小结

英文缩写注解

攻读博士学位期间研究成果

致谢

声明

统计学证明