人甲状腺癌中肿瘤干细胞样细胞的分离培养与鉴定

摘要

研究背景:
　　恶性肿瘤是导致人类死亡的主要原因之一，关于肿瘤的发生、发展、侵袭、转移及治疗一直是医学研究领域的热点。甲状腺癌是最常见的甲状腺恶性肿瘤，约占全身恶性肿瘤的1％，根据国外文献报告该发病率约为0.5～10/10万，而近年来有呈上升发展的趋势。根据甲状腺肿瘤分化的程度，甲状腺癌根据组织学分型可以分类为分化型甲状腺癌及未分化型甲状腺癌。根据组织学来源，分化型甲状腺癌又可以分类为乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌，前者占全部甲状腺癌的75％，后者占16％;另有甲状腺髓样癌，占5％;未分化型甲状腺癌，占3％。不同病理类型的甲状腺癌，其生物学特性、临床表现、诊断治疗及预后均有所不同。甲状腺癌中绝大部分为高分化癌，预后较好。但亦有一些低分化或未分化甲状腺癌，易早期发生远处转移，患者在诊断时常已进入临床晚期，其对目前的临床治疗包括手术、放射碘以及终身服用左旋甲状腺素的替代等治疗手段疗效不佳，预后较差。因此，研究甲状腺癌的发病机制具有非常重要的临床意义。
　　传统的理论认为[1]，恶性肿瘤的形成是由成熟的细胞突变而来的，它的形成是由均一的肿瘤细胞共同增殖、发展及突变而构成的。而近年来的研究表明[2]，肿瘤细胞具有异质性，也就是说并不是所有的肿瘤细胞都具有形成新肿瘤的能力。新近的研究发现[3]，恶性肿瘤组织中存在着少量干细胞样亚群，它具有无限增殖的潜能，其在启动恶性肿瘤形成和生长中起着决定性的作用，而其余的大多数的肿瘤细胞，经过短暂的分化而最终死亡。恶性肿瘤的生长是肿瘤组织中少量具有特殊表面标志的肿瘤干细胞增殖的结果，这一理论提示着，在恶性肿瘤的治疗中应针对在肿瘤发生、发展中起决定性作用的肿瘤干细胞，而不是大部分无增殖、分化能力的肿瘤实体细胞。越来越多的证据表明，恶性肿瘤的生长与转移需要这样的细胞亚群，它们具有干细胞的特征，因而被称为肿瘤干细胞[5]。
　　恶性肿瘤进行性生长、转移和复发的特点与干细胞的发生发展有许多相似之处，肿瘤干细胞与干细胞的共性分别有[6]:(1)都具有自我更新和增殖能力，但肿瘤细胞增殖不受正常机体内微环境的调控，是失去调控的;(2)都具有不同的表型和异质性，干细胞表面特殊的表型用于调控自身增殖及周围细胞分化的功能，肿瘤干细胞亚型不同，其生长分化能力、侵袭能力及耐药性也不同;(3)相似的生长调节机制和信号转导通路，都具有端粒酶活性，在正常干细胞的恶性转化实验中发现，端粒酶活性和附加基因突变是正常干细胞恶性转化的两个必要条件;(4)都具有多分化潜能;(5)都有相似的表面标志物，如正常造血干细胞和白血病细胞都表达CD34和CD90。
　　肿瘤干细胞学说从一个崭新的角度阐述了恶性肿瘤发病的起源问题，其研究的视线开始从肿瘤细胞转向为肿瘤干细胞，并从这个新的角度重新理解恶性肿瘤发展的生物学行为。该学说认为，肿瘤干细胞不仅主导着恶性肿瘤的发生，更与恶性肿瘤的进一步发展，包括复发及转移，以及肿瘤对放、化疗的耐受性等密切相关。根据肿瘤干细胞理论提示，甲状腺癌的发生可能也来源于甲状腺癌干细胞，因此，从甲状腺癌组织中分选和鉴定出甲状腺癌干细胞对研究甲状腺癌形成的生物学机制及临床预防、诊断和治疗十分重要。
　　肿瘤干细胞筛选最常用的手段是利用肿瘤干细胞表面特异标志物，可分为荧光活化细胞分选术和免疫磁珠分选术[7]。而不依赖于细胞表面标记的侧群细胞分选法，则是利用干细胞能够将荧光染料Hoechst33342外排的特性，对Hoechst33342拒染或淡染，通过流式细胞仪对这一部分细胞进行分选或检测，利用这种特性分选的这部分肿瘤细胞称为侧群细胞。侧群细胞是一个特殊的细胞亚群，它的分化状态介于胚胎干细胞及成体干细胞之间[8]。它具有多向分化、无限增殖及自我更新潜能。目前已从多种肿瘤如胆囊癌、肺癌、乳腺癌、胃肠道肿瘤等中分选出了侧群细胞，并同时证实了这些细胞亚群具有自我更新和多向分化的干细胞特性[9-12]。与利用肿瘤干细胞表面特异标志物筛选肿瘤干细胞的方法相比，侧群细胞分选法更为经济方便，同时还可用以表型标记未知的癌干细胞的分选。
　　由于侧群细胞具有成熟的分选方法，本研究拟以人甲状腺癌组织为研究对象，采用流式细胞分选技术分选出人甲状腺癌侧群细胞和非侧群细胞，通过Western blot来检测侧群细胞和非侧群细胞在Oct-4、ABCG2表达方面的差异，对分选出的侧群细胞特性进行鉴定，探索在人甲状腺癌中是否存在具有干细胞特性的侧群细胞，为甲状腺癌的发病机制提供新的思路。
　　研究目的:
　　1、利用流式细胞分选技术，探索在人甲状腺癌组织中是否存在具有干细胞特性的侧群细胞;
　　2、从人甲状腺癌组织中分离、培养及鉴定干细胞亚群，初步研究甲状腺癌细胞中干细胞亚群的生物学特性。
　　研究方法:
　　1、人甲状腺癌组织来源细胞的原代培养及细胞传代:
　　收集标本，并原代培养甲状腺癌细胞。本研究人甲状腺癌组织，取材于南方医科大学第三附属医院普通外科，经手术切除的甲状腺癌标本，并经病理证实为甲状腺癌后，行分离培养出甲状腺癌细胞;无菌条件下将新鲜甲状腺癌组织洗净剪碎，经0.1％的胰酶和0.025％的Ⅰ型胶原酶37℃消化30 min，然后滤网过滤去渣，4℃下500×g离心5 min，去除上清;用5ml含有20％人血浆的DMEM-E培养基孵育5min，细胞重悬后经20％的Percoll在4℃下1500×g离心15min，收集含细胞的沉淀，再经DMEM-E洗涤2次，每次4℃下500×g离心5min。所获细胞移至培养瓶中，以含有10％FBS、100 g/ml牛脑抽提物、2mmol/L谷氨酰胺、100 U/ml青霉素、100mg/ml链霉素的DMEM-E培养基培养48h，弃上清，洗掉非贴壁细胞后继续培养，1周后挑取多个形成的集落，混均匀，移至新瓶培养。第8代时挑取非铺路石样形态的细胞集落，然后分开培养。
　　2、利用流式细胞术分选侧群细胞及非侧群细胞:
　　收集上述培养细胞，调整细胞密度至1×106个/ml，参照Kondo等的方法，将甲状腺癌细胞群消化为单细胞悬液，加入Hoechst33342染料至终质量浓度为5μg/ml，而对照组则加入维拉帕米至终质量浓度50μg/ml，37℃孵育90 min，弃上清，用预冷PBS洗3次，加入碘化丙啶至终质量浓度2μg/ml。以350nmμV激发光源、610nm双色短通反射滤镜、450、675nm边缘长通滤片分别检测散射光蓝光及红光部分，线性模式采集信号，将细胞中荧光信号分为两个部分，以Hoechst红点为x轴，Hoechst蓝点为y轴作二维散点图，将低Hoechst红点及低Hoechst蓝点且对照组缺失的区域设定为SP细胞的“门”，分别分选出SP细胞及非SP细胞。
　　3、运用Western blot法检测ABCG2、Oct-4蛋白的表达:三去污剂法分别提取甲状腺癌SP细胞及非SP细胞的总蛋白，经10％SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离后，电转移至PVDF膜上，然后用5％脱脂奶粉室温封闭2h，漂洗后与一抗（1∶200稀释）4℃缓慢摇动过夜，用TBS-T洗脱后与HRP标记的羊抗Rat、羊抗Rabbit以及羊抗Mouse二抗（1∶1000稀释）室温孵育2h，洗膜，化学发光显影，曝光观察ABCG2、Oct-4蛋白的表达情况。
　　4、统计学方法所有计量资料以均数±标准差（X±S）表示，应用SPSS19.0 forWindows统计软件分析，采用t检测与方差分析。
　　研究结果:
　　1、人甲状腺癌中存在着具有干细胞潜能的侧群细胞。实验组（未加入维拉帕米）分选出侧群细胞含量为1.40％，对照组（加入维拉帕米）分选侧群细胞含量为0.155％，差异具有统计学意义(p＜0.05)。
　　2、Western blot结果显示该侧群细胞高表达干细胞标志0CT4以及肿瘤耐药基因ABCG2。
　　研究结论:
　　人甲状腺癌的起源与肿瘤干细胞密切相关，并且在甲状腺癌细胞株中存在着具有干细胞特性的甲状腺癌SP细胞，该群细胞高表达干细胞标记OCT4及肿瘤耐药基因ABCG2。因此，甲状腺癌侧群细胞可能是甲状腺癌耐药、复发、转移的根源，提示今后的研究方向是更多是针对该侧群细胞的靶向治疗。

目录

摘要

前言

第一部分 材料和方法

1．1 实验材料与主要试剂

1．2 实验方法

1．3 统计学方法

第二部分 实验结果

2．1 分离培养的甲状腺癌细胞来源的患者资料

2．2 分离培养的甲状腺癌细胞形态学观察

2．3 流式细胞术分选SP细胞结果

2．4 Western blot检测Oct-4和ABCG2表达结果

第三部分 讨论

第四部分 结论与展望

4．1 结论

4．2 不足与展望

4．3 实验延伸

参考文献

攻读学位期间成果

致谢

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