白藜芦醇对离体人肺内小动脉血管舒张作用及其机制研究

摘要

目的：本研究利用人的肺内小动脉作为研究对象，观察白藜芦醇对离体人肺内小动脉血管张力的影响及推测其舒张血管的作用机制。目前用于血管张力实验的血管主要有阻力血管和弹力血管，阻力血管舒缩状态能够影响血压变化，本研究选取的直径为1～1.5 mm的肺内小动脉属于阻力血管。因此，本实验能够为白藜芦醇的降压作用提供实验室研究数据，从而对以后白藜芦醇的临床用药有指导作用。
　　材料和方法：
　　1.标本来源
　　本实验标本来源于2014年5月8日～2014年7月28日在广东省人民医院因肺癌行肺叶切除手术的病人，年龄20～73岁，男22例，女13例。ASA分级Ⅰ～Ⅱ级，肺功能正常，排除高血压、糖尿病、肺动脉高压患者。均已告知患者标本的用途，并均已签署标本的采集知情同意书。本研究已通过广东省人民医院医学伦理委员会伦理批准（粤医科伦理2010079H号）。取距离癌组织边缘5 cm以上的正常肺组织作为本实验的研究标本。
　　2.血管环的制备
　　选取距离癌组织5 cm以上的正常肺组织，将肺组织放入装有预冷(4℃)且混合气(95％ O2+5％ CO2)饱和过的Kreb's液中，固定于硅胶板上，体视显微镜下仔细分离肺内小动脉（直径1～1.5 mm），制备成长度为1.5～2 mm的动脉环，用两根直径为40 um的钢丝穿过管腔，固定于张力测定仪浴槽内的两个钳夹上。平衡60 min，期间每隔15 min更换Kreb's液一次，调节基础张力至1.8～2.0 mN。浴槽内持续通入95％ O2+5％ CO2混合气，温度恒定在37℃，以模拟人体内环境。需要机械去内皮的血管环时，不锈钢丝来回摩擦血管管腔30次。
　　3.血管反应性检测
　　血管环平衡60 min后，将浴槽内的Kreb's液更换成60 mmol/L高钾溶液，高钾溶液能够使肺内小动脉收缩，待张力稳定到一平台期，以Kreb's液充分洗净(4次，每次间隔5 min)至张力恢复基线水平，重复上述实验两次。前后两次高钾刺激后血管收缩幅度相差不超过10％进行下一步实验。
　　4.内皮完整性检测
　　高钾检测血管反应性后平衡血管环30 min，加入5-HT2 umol/L收缩血管，待张力稳定后加入Ach1 umol/L舒张血管，血管舒张大于60％视为内皮完整，舒张小于10％视为内皮不完整。Kreb's液充分洗净，张力恢复至基线水平30 min后进行下一步实验。
　　5.实验内容
　　5.1 白藜芦醇对静息状态下血管张力的影响
　　5.2 白藜芦醇对U46619、内皮素-1、氯化钾预收缩的肺内小动脉的影响
　　5.3 白藜芦醇对预收缩内皮完整和机械去内皮的人肺内小动脉舒张效应
　　5.4 NO合酶抑制剂L-NAME孵育后对白藜芦醇舒张血管效应的影响
　　5.5 吲哚美辛孵育后对白藜芦醇舒张血管效应的影响
　　5.6 K+通道阻滞剂对白藜芦醇舒张作用的影响
　　5.7 Ca2+通道对白藜芦醇舒张作用的影响
　　6.数据测定及统计处理
　　以加入收缩剂预收缩最大收缩幅度为100％，加入白藜芦醇后血管舒张与最大收缩幅度的比值的百分比反应血管张力的变化，EC50表示产生50％最大舒张效应时的药物浓度，pD2为产生最大效应的50％时激动剂摩尔浓度的负对数，pD2=-lg(EC50)，最大舒张作用的变化值为Emax。数据用均数±标准差表示，统计学采用SPSS13.0，采用Prism5.0软件对数据进行曲线拟合，绘制舒张曲线。两组间比较采用独立样本t检验，P＜0.05认为具有统计学差异。
　　结果：
　　1.白藜芦醇对静息状态下血管张力的影响
　　累积浓度白藜芦醇(10、30、100、300、1000 umol/L)对静息状态下内皮完整人肺内小动脉血管环张力无影响。
　　2.白藜芦醇对U46619、内皮素-1、氯化钾预收缩的肺内小动脉的影响
　　累积浓度的白藜芦醇对U46619、ET-1、60 mmol/L KCl预收缩内皮完整的血管环有舒张作用，并呈浓度依赖性，其pD2分别为3.82±0.20，3.84±0.57，3.68±0.27，Emax分别为(99.58±0.83)％，100％，(99.65±0.98)％，溶剂对照组无明显的舒张作用。
　　3.白藜芦醇对用100 umol/L L-NAME孵育血管环张力的影响
　　累积浓度的白藜芦醇对用100 umol/L L-NAME孵育30 min的血管环有舒张作用，并呈浓度依赖性，pD2为3.64±0.10，Emax为(98.97±2.30)％，且在100 umol/L时，同未加L-NAME孵育的血管环比较，两者之间具有统计学差异，L-NAME可能导致白藜芦醇舒张作用右移，说明白藜芦醇的舒张作用可能与促进内皮的NO释放有关。
　　4.白藜芦醇对用10 uM/L吲哚美辛孵育血管环张力的影响
　　累积浓度的白藜芦醇对用10 uM/L吲哚美辛孵育30 min的血管环有舒张作用，并呈浓度依赖性，pD2为3.91±0.31，Emax为100％，两者之间没有统计学差异，说明白藜芦醇的舒张作用可能与环氧合酶无关。
　　5.白藜芦醇对机械去内皮血管环的影响
　　累积浓度的白藜芦醇对机械去内皮的血管环有舒张作用，并呈浓度依赖性，pD2为4.04±0.05，Emax为100％，说明白藜芦醇舒张作用不依赖于内皮。
　　6.K+通道阻滞剂对白藜芦醇舒张作用的影响
　　内皮完整的血管环，使用格列本脲（ATP敏感的K+通道阻滞剂）、BaCl2(内向整流K+通道阻滞剂)、TEA+(大电导Ca2+激活K+通道阻滞剂)预孵育后，累积加入白藜芦醇对血管环有舒张作用，并呈浓度依赖性，pD2分别为4.04±0.04、3.77±0.07、3.92±0.1，Emax分别为(100±6.81)％、(100±5.98)％、(100±7.18)％，说明白藜芦醇的舒张作用不依赖于K+通道。
　　7.Ca2+通道对白藜芦醇舒张作用的影响
　　7.1 硝苯地平对白藜芦醇舒血管效应的影响
　　选取去内皮的血管环，加入L型VGCC阻断剂硝苯地平(100nM/L)预孵育，U46619收缩血管，累计加入白藜芦醇后对肺内小动脉仍然有舒张作用，并呈浓度依赖性，pD2为3.92±0.06，Emax为(99.25±2.6)％，在100 umol/L时两者有差异性，说明白藜芦醇舒张作用可能与L型VOCC有关。
　　7.2 TXA2受体相关ROCC对白藜芦醇舒张血管的影响
　　机械去内皮的血管环，加入硝苯地平预孵育，对不同血管分别加入10umol/L、30 umol/L、100 umol/L的白藜芦醇孵育30 min，然后累积加入U46619（10-9～10-6）后血管发生收缩反应，但能部分抑制U46619引起的收缩反应，呈浓度依赖性，提示白藜芦醇的舒张血管活性可能与TXA2受体相关ROCC有关。
　　7.3 内钙释放对白藜芦醇舒张血管的影响
　　去内皮血管环于无Ca2+的Krebs液中，硝苯地平存在的条件下，不同浓度白藜芦醇及二甲亚砜孵育，白藜芦醇能抑制U46619引起的血管环收缩反应，表明白藜芦醇的舒张血管效应可能与内钙释放有关。
　　结论：
　　1.白藜芦醇能够舒张人肺内小动脉;
　　2.白藜芦醇舒张人肺内小动脉的机制不依赖于内皮，与K+通道也无关，可能与促进内皮释放NO、L型VOCC、TXA2受体相关ROCC和内钙释放有关。

目录

摘要

前言

第二章 材料与方法

1 试剂与药品

2 仪器

3 实验前准备

4 血管环的制备

5 血管反应性检测

6 内皮完整性检测

7 实验内容

8 数据测定

9 统计学分析

第三章 结果

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

缩略词

攻读研究生期间成果

致谢

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