硅酸二钙颗粒/涂层对单核/巨噬细胞的促炎作用和成骨效应研究

摘要

本文主要从以下几个方面进行论述：
　　第一章:硅酸二钙颗粒对人外周血单核细胞、人单核细胞系THP-1、人成骨细胞系MG-63的细胞毒性作用
　　制备硅酸二钙颗粒，对硅酸二钙颗粒和羟基磷灰石颗粒进行表征分析。如颗粒扫描电镜分析、颗粒表面元素分析、颗粒粒径分析及比表面积分析。扫描电镜可见两种材料的颗粒大小和形状不同。表面元素分析可见硅酸二钙颗粒中含有Ca、Si、O等元素;羟基磷灰石颗粒Ca5(PO4)3(OH)含有Ca、Si、P、O等元素，与材料应含有的元素相符。X-射线衍射分析可见样品的X-射线衍射峰与标准品衍射峰相吻合，说明样品的物相较纯。激光衍射粒径分析见硅酸二钙颗粒的粒径范围是3～22μm，羟基磷灰石是1.9～80μm。两种材料的比表面积分析可见两种材料的比表面积不同。通过计算比表面积比，台盼蓝染色，CCK-8和细胞凋亡检测不同比表面积比（10/1，5/1和1/1）颗粒对免疫细胞的细胞毒性作用。在本研究中选择了人外周血单核细胞，THP-1以及MG-63作为研究对象。单核细胞是首先与生物材料接触的细胞，种植体涂层脱落的颗粒或者骨水泥植入体内后，单核细胞首先聚集在这些材料所在的部位，单核细胞吞噬这些颗粒后可能出现细胞毒性，导致细胞死亡或凋亡。硅酸二钙作为种植体涂层材料或者骨替代材料，主要与骨细胞发生相互作用，促进成骨细胞增殖分化。所以在本实验中我们选择了最常用的MG-63作为实验对象。实验结果证实硅酸二钙颗粒对人外周血单核细胞无明显细胞毒性作用。CCK-8分析结果可见，硅酸二钙和羟基磷灰石对三种细胞均无明显的细胞毒性作用，材料与细胞共培养24 h和48 h后均有85％以上细胞为活细胞。在实验结果中，人外周血单核细胞与硅酸二钙共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为95.38±3.79％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为93.88±4.67％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在98.05±1.39％，细胞毒性分级为1级。人外周血单核细胞与羟基磷灰石颗粒共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为90.00±7.61％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为94.93±2.08％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在91.73±3.74％，细胞毒性分级为1级。人外周血单核细胞与硅酸二钙共培养48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为88.48±11.79％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为88.17±9.57％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在92.81±18.52％，细胞毒性分级为1级。而人外周血单核细胞与羟基磷灰石共培养48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为91.94±24.37％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为95.95±6.50％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在95.36±23.85％，细胞毒性分级为1级。共培养24 h时硅酸二钙组的细胞存活率均高于羟基磷灰石的存活率，而共培养48 h后硅酸二钙组的细胞存活率低于羟基磷灰石组，但所有实验组细胞存活率均在85％以上。
　　THP-1与硅酸二钙颗粒共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为89.10±13.02％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为84.44±12.86％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在86.85±20.41％，细胞毒性分级为1级。THP-1与羟基磷灰石颗粒共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为99.23±27.40％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为97.14±7.88％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在91.44±28.56％，细胞毒性分级为1级。人单核细胞系THP-1与硅酸二钙颗粒共培养48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为92.03±3.68％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为98.49±7.00％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在109.52±3.06％，细胞毒性分级为0级。THP-1与羟基磷灰石颗粒共培养，48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为105.24±2.39％，细胞毒性分级为0级;SAR5∶1的细胞存活率为110.01±6.95％，细胞毒性分级为0级;SAR1∶1的细胞存活率在103.46±2.45％，细胞毒性分级为0级。提示低剂量的硅酸二钙颗粒和羟基磷灰石颗粒能刺激THP-1细胞增殖。
　　MG-63与硅酸二钙颗粒共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为125.57±8.90％，细胞毒性分级为0级;SAR5∶1的细胞存活率为119.59±11.32％，细胞毒性分级为0级;SAR1∶1的细胞存活率在108.36±3.06％，细胞毒性分级为0级。MG-63与羟基磷灰石颗粒共培养24 h后，SAR10∶1的细胞存活率为120.09±9.15％，细胞毒性分级为0级;SAR5∶1的细胞存活率为110.06±5.43％，细胞毒性分级为0级;SAR1∶1的细胞存活率在119.73±15.20％，细胞毒性分级为0级。MG-63与硅酸二钙颗粒共培养48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为87.05±1.35％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为95.88±3.16％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在93.86±3.30％，细胞毒性分级为1级。MG-63与羟基磷灰石颗粒共培养48 h后，SAR10∶1的细胞存活率为84.50±4.00％，细胞毒性分级为1级;SAR5∶1的细胞存活率为88.60±6.14％，细胞毒性分级为1级;SAR1∶1的细胞存活率在95.59±4.06％，细胞毒性分级为1级。提示硅酸二钙和羟基磷灰石颗粒在24 h内对成骨细胞具有促进细胞增殖的效应，而48 h后细胞增殖有一定变化，但细胞存活率仍在85％以上。
　　流式细胞术检测结果显示不同比表面积比(SARs)的硅酸二钙颗粒/羟基磷灰石颗粒对人外周血单核细胞凋亡的影响。人外周血单核细胞与硅酸二钙/羟基磷灰石共培养后，SAR10∶1的细胞凋亡率为分别为6.16±0.77％和5.29±0.48％。硅酸二钙引起较大的细胞凋亡比例，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，但硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异无统计学意义(P＞0.05)。SAR5∶1的细胞凋亡率为分别为5.49±0.48％和7.25±1.48％。羟基磷灰石引起较多的细胞凋亡比例，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，但硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。SAR1∶1的细胞凋亡率分别为4.96±0.079％和4.32±1.30％。硅酸二钙组/羟基磷灰石组与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。
　　THP-1与硅酸二钙/羟基磷灰石共培养后，SAR10∶1的细胞凋亡率为分别为8.88±0.77％和6.03±1.45％。硅酸二钙引起较大的细胞凋亡比例，与对照组比较有统计学意义(P＜0.05)，硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异有统计学意义(P＜0.05)。SAR5∶1的细胞凋亡率为分别为5.83±0.72％和6.32±0.75％。硅酸二钙/羟基磷灰石与对照组比较均无统计学意义，硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异无统计学意义（P＞0.05）。SAR1∶1的细胞凋亡率为分别为5.98±0.48％和4.46±1.53％。硅酸二钙组/羟基磷灰石组与对照组比较差异均无统计学意义(P＞0.05)，硅酸二钙组与羟基磷灰石组两组间比较差异亦无统计学意义（P＞0.05）。
　　结果表明硅酸二钙颗粒是相对较安全的生物材料。
　　第二章:硅酸二钙颗粒的体外促炎作用和成骨效应
　　细胞外基质降解是评价生物材料安全性的关键环节，是评估炎症细胞对生物材料的反应。为了探索硅酸二钙颗粒/羟基磷灰石颗粒对THP-1细胞基质金属蛋白酶类以及肿瘤坏死因子-α等的影响，本实验应用荧光定量RT-PCR法分析基质金属蛋白酶-2、基质金属蛋白酶-9（MMP-2和MMP-9）及基质金属蛋白酶抑制剂-2、基质金属蛋白酶抑制剂-1（TIMP-2和TIMP-1）的表达情况。
　　对TNF-α mRNA的表达水平进行分析，结果显示，6h和24 h时，脂多糖和酵母多糖均引起高水平的TNF-α表达。6h时，硅酸二钙组和羟基磷灰石组均未引起明显的TNF-α表达变化。24 h后，硅酸二钙组和羟基磷灰石组均上调TNF-α表达(P＜0.05)，但与羟基磷灰石组相比，硅酸二钙组的上调幅度较小，两组比较差异有统计学意义（P＜0.05）。
　　由研究结果可见，硅酸二钙可能比羟基磷灰石相对安全，引起的促进炎症效应较弱。硅酸二钙和羟基磷灰石均对LPS激活细胞炎症因子的表达无调节作用。硅酸二钙和羟基磷灰石具有相似的成骨效应。
　　第三章:硅酸二钙涂层对鼠巨噬细胞系RAW264.7的细胞毒性研究 本研究将RAW264.7与硅酸二钙涂层共培养，通过细胞毒性检测试剂盒检测硅酸二钙涂层对264.7的细胞毒性作用。实验结果显示硅酸二钙涂层/生物玻璃45S5涂层对RAW264.7无细胞毒性，属毒性分级1级。
　　本研究证明硅酸二钙颗粒及涂层是一种生物安全性较高的生物材料，其体外促进炎症因子分泌的能力可能比羟基磷灰石弱，提示其作为骨替代材料或种植体涂层材料的潜在应用前景。

目录

摘要

前言

第一章 硅酸二钙颗粒对人外周血单核细胞／人单核细胞系及成骨细胞系细胞毒性的影响

1．1 材料与方法

1．2 结果

1．3 讨论

1．4 小结

第二章 硅酸二钙颗粒的体外促炎效应和成骨效应

2．1 材料与方法

2．2 结果

2．3 讨论

2．4 小结

第三章 硅酸二钙钛涂层制备以及涂层对鼠巨噬细胞系RAW264．7的细胞毒性作用

3．1 材料与方法

3．2 结果

3．3 讨论

3．4 小结

全文总结

参考文献

在读期间的科研业绩

中英文对照缩略词语表

致谢

声明

统计学审稿证明