MyD88依赖性NF-κB通路在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用机制研究

摘要

角膜盲是临床上最常见的致盲性眼病之一，严重影响患者的视觉质量。角膜移植手术是治疗不可逆性角膜盲的最有效治疗方法。
　　研究发现，Toll受体(Toll-like receptors，TLRs)广泛表达于眼表和DC细胞中，参与眼表各种炎症反应。其中髓样分化因子88(MyD88)是TLRs受体家族中大部分成员接受抗原刺激信号转导到NF-κB的重要衔接蛋白。研究发现，Toll样受体2(TLR2)和NF-κB在糖皮质激素和免疫抑制剂环孢霉素A防治大鼠角膜移植免疫排斥中表达下降。髓样分化因子88(MyD88)基因敲出可以促进小鼠肾脏移植术后肾功能恢复和诱导免疫耐受。因此，我们推测MyD88依赖性NF-κB通路参与大鼠角膜移植免疫排斥反应，阻断TLRs信号通路下游的MyD88和核转录因子NF-κB表达对于研究如何预防角膜移植排斥反应和诱导角膜移植免疫耐受具有重要意义。
　　第一部分NF-κB抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究
　　目的：
　　探讨NF-κB抑制剂在大鼠穿透性角膜移植排斥反应中的作用机制。
　　方法：
　　建立大鼠穿透性角膜移植模型40只，随机分为四组:Isograft组、Allograft组、Dexamethasone组和PDTC组，术后第1天开始，Isograft组、Allograft组给予妥布霉素滴眼液，Dexamethasone组给予妥布霉素地塞米松滴眼液，PDTC组给予妥布霉素眼液与10mg/L PDTC滴眼液，1滴/次，4次/天，术后观察各组角膜植片排斥反应，进行RI(rejection index)评分和生存分析(survival analysis)，术后15天行角膜组织HE染色和TNF-α免疫组化，RT-PCR检测角膜组织中TLR2、MyD88和NF-κB P65 mRNA表达，western blotting检测角膜组织中TLR2、MyD88和NF-κB P65蛋白表达量的变化。
　　结果：
　　术后5、7、9、11、13和15天，Isograft组、Allograft组、PDTC组、Dexamethasone组，四组角膜植片RI比较具有统计学差异(F=257.705，P＜0.001)。Allgraft组RI高于其余三组具有统计学差异(P＜0.05）。PDTC组角膜植片生存时间中位数（MST)(MST,23days，n=10),Isograft组(MST,19days，n=10),Allograft组(MST，14days，n=10)和Dexamethasone组(MST，25days，n=10)，四组间角膜植片生存时间中位数比较具有统计学差异（x2=66.491，P＜0.001）。
　　结论：
　　Dexamethasone可以通过MyD88依赖性NF-κB通路抑制大鼠角膜移植排斥反应，PDTC可以通过抑制NF-κB活性抑制大鼠角膜移植排斥反应，MyD88依赖性NF-κB信号通路可以作为防治大鼠角膜移植排斥反应的重要调控通路。
　　第二部分MyD88抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用研究
　　目的：
　　初步探讨MyD88抑制剂在大鼠角膜移植排斥反应中的作用。
　　方法：
　　建立大鼠穿透性角膜移植模型，随机分为三组:Allograft组，Dexamethasone组和MyD88抑制剂组，术后第1d开始，Allograft组给予妥布霉素滴眼液滴术眼，Dexamethasone组给予妥布霉素地塞米松滴眼液滴术眼，MyD88抑制剂组给予妥布霉素滴眼液与2mg/ml ST2825滴眼液滴术眼，1滴/次，4次/日，裂隙灯显微镜观察各组角膜植片排斥反应，进行角膜植片RI评分和生存分析。
　　结果：
　　术后5、7、9、11、13和15天，Allograft组，Dexamethasone组和MyD88抑制剂组，三组间RI排斥指数比较具有统计学差异(F=91.870，P＜0.05)。术后5、7、9、11、13和15天，Dexamethasone组和ST2825组的RI指数低于Allograft组具有统计学差异(P＜0.05)。
　　结论：
　　MyD88特异性抑制剂ST2825短期内局部滴眼未见明显眼部毒副作用，其具有一定的抑制大鼠角膜移植免疫排斥的作用，可能与抑制角膜组织中MyD88表达相关。
　　第三部分树突状细胞中NF-κB在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究
　　目的：
　　探讨Lv-siRNA-Rel-A转染大鼠髓源性DC在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用机制。
　　方法：
　　(1)应用含5ng/ml粒-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)与5ng/ml IL-4的RPMI-1640培养液诱导分化培养大鼠髓源性DC，流式细胞仪分析DC表面刺激分子CD86、MHCⅡ、OX62表达，混合淋巴细胞反应(MLR)检测其刺激同种T淋巴细胞增殖能力。
　　(2)应用高效抑制Rel-A表达的shRNA序列，构建Lv-siRNA-Rel-A载体，Westem blotting验证其抑制Rel-A表达功能。将Lv-siRNA-Rel-A载体转染大鼠DC，应用Western blotting检测DC中Rel-A蛋白表达，流式细胞仪分析转染后DC表型分子CD80、CD86、MHCⅡ表达变化，MLR检测其刺激同种T细胞增殖能力。
　　(3)将负载供体抗原的2×106个培养第7d的Lv-shRNA-Rel-A DC于术前7d注入大鼠穿透性角膜移植模型中，术后裂隙灯显微镜观察角膜植片排斥情况，进行RI评分，Western blotting和RT-PCR检测大鼠角膜组织中TLR2、MyD88、NF-κB P65的蛋白和mRNA表达变化。
　　结果：
　　(1)RPMI-1640含5ng/ml GM-CSF与5ng/ml IL-4的培养液可以获得足量大鼠髓源性DC，表达中等水平MHCⅡ和低水平CD86，刺激同种T细胞增殖能力低。共刺激分子MHCⅡ、CD86、OX62三组间具有统计学差异(F=969.213，P＜0.001)。
　　(2)2.5×103 DC组、5×103DC组、1×104DC组，三组间DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力差异具有统计学意义(F=23.889，P＜0.05)，其中2.5×103 DC组光吸收度A值低于5×103DC组(P=0.001)和1×104 DC组(P＜0.001)具有统计学差异，5×103 DC组光吸收度A值低于1×104 DC组具有统计学差异(P=0.008)。培养第12d，DC刺激同种异体T细胞的增殖能力显著增强。
　　(3)构建Lv-siRNA-Rel-A慢病毒载体，RNA干扰组(Lv-siRNA-Rel-A转染DC组)大鼠DC中CD80，CD86的表达显著低于DC空载体对照组具有统计学差异(P＜0.05），这说明siRNA-Rel-A可以降低DC表面刺激分子CD80、CD86的表达。RNA干扰组DC表面MHCⅡ分子表达下降不显著(P=0.080)。
　　(4)空白对照组（A组）、转染试剂对照组（B组）、阴性siRNA对照组（C组）与Rel-A-siRNA组（D组），四组间DC刺激同种T淋巴细胞增殖能力差异具有统计学意义(F=105.31，P＜0.01); LPS刺激DC和Lv-siRNA-Rel-A转染DC后，LPS-siRNA-DC组刺激T细胞增殖能力较LPS-DC组弱具有统计学差异(P＜0.05）。这说明Lv-siRNA-Rel-A转染DC可以降低其刺激同种T细胞增殖的能力。
　　(5)空白对照组（A组）、试剂转染组（B组）、空载体组（C组）与siRNA-Rel-A组（D组），四组间Rel-A蛋白表达比较，siRNA-Rel-A组分别与空载体组和空白对照组比较，DC中Rel-A蛋白表达量显著下降（P＜0.05）。
　　(6)同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组，五组间角膜植片RI评分经球形检验(Mauchly's Test of Sphericity)，W=0.967，x2=0.642，P=0.725，接受球形假设。术后5d、10d、15d，五组间RI评分比较具有统计学差异(F=78.556，P＜0.05)。
　　(7)术后15天，正常组、同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组，六个实验组中Rel-A蛋白相对表达量比较具有统计学差异（P＜0.05），治疗组角膜组织中Rel-A蛋白表达下降，NF-κB活性下降。
　　(8)正常角膜组织表达一定量TLR2与MyD88 mRNA。术后15天，正常组、同种同体组、同种异体组、DC组、空载体组与治疗组，六组间角膜组织中TLR2mRNA表达的差异倍数有显著性差异(F=27.807，P＜0.001)。
　　结论：
　　DC转染Lv-siRNA-Rel-A可以下调DC中Rel-A表达，降低DC表面CD80、CD86分子表达，维持未成熟化DC，抑制同种T淋巴细胞增殖反应。Lv-siRNA-Rel-A转染DC负载供体抗原后注入大鼠角膜移植体内，可以下调角膜组织中TLR2、MyD88、NF-κB(Rel-A)蛋白表达，延缓大鼠角膜移植排斥反应。MyD88依赖性NF-κB通路具有一定调控大鼠角膜移植免疫排斥的作用。

目录

摘要

第一部分．NF-κB抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究

1．1 材料与方法

1．2 实验方法

1．3 统计学分析

2．结果

2．1 临床观察

2．2 各组角膜植片的生存分析

2．3 各组角膜组织病理学改变

2．4 角膜植片TNF-α表达

2．5 角膜组织中TLR2、MyD88和p65的mRNA表达

2．6 各组角膜组织中TLR2、MyD88和p65的蛋白表达

3．讨论

参考文献

第二部分．MyD88抑制剂在大鼠角膜移植免疫排斥中作用研究

1．材料与方法

1．1 材料

1．2 实验动物及分组

1．3 建立同种异体大鼠穿透性角膜移植模型

1．4 裂隙灯显微镜观察和排斥反应指数评分

1．5 裂隙灯显微镜观察角膜植片进行生存分析

1．6 统计学分析

2．结果

2．1 临床观察与RI比较

2．2 角膜植片生存分析

3．讨论

参考文献

第三部分．树突状细胞中NF-κB在大鼠角膜移植免疫排斥中作用机制研究

1．材料与方法

1．1 主要试剂和仪器

1．2 配制主要试剂

1．3．实验方法

1．4 构建针对NF-κB中Rel-A的shRNA慢病毒载体

1．5．RNA干扰DC中Rel-A基因负载供体抗原在大鼠角膜移植免疫排斥中的作用

1．6 统计学分析

2．结果

2．1 诱导大鼠髓系源性未成熟树突状细胞

2．2 流式分析GM-CSF联合IL-4诱导DC表型

2．3 混合淋巴细胞反应(MLR)

2．4．流式分析Lv-shRNA-Rel-A转染DC表型

2．5．Lv-siRNA-Rel-A转染DC混合淋巴细胞反应(MLR)

2．6 各组树突状细胞中Rel-A蛋白表达

2．7 RNA干扰DC中Rel-A表达在大鼠角膜移植中的作用

3．讨论

参考文献

全文总结

综述 MyD88依赖性NF-κB通路在眼表疾病中的作用研究进展

中英文对照缩略词表

攻读研究生期间发表论文及成果

致谢

声明

统计学审稿证明