PLGA、壳聚糖、纳米银混合物的制备及生物学特性初步研究

摘要

目的：
　　本课题旨在制备PLGA、CS纳米粒(nPLGA、nCS)并研究nPLGA、nCS和nAg对牙周膜细胞毒性、增殖与矿化的影响及抗菌特性。为后期用于牙周组织修复与再生的纳米复合支架的制备和生物学性能的研究及临床应用奠定基础。
　　方法：
　　第一章 nPLGA、nCS的制备及物理学特征
　　1.nPLGA的制备:采用乳化溶剂挥发法[30]制备nPLGA:将100mgPLGA溶于10ml丙酮中，室温下磁力搅拌800rpm/min至完全溶解后缓慢倒入40ml2％聚乙烯醇溶液中，并继续磁力搅拌8h;待溶剂完全挥发后（溶液呈淡蓝色），15，000rpm/min离心15min，去上清，沉淀部分用去离子水清洗三次并重悬后，超声混匀处理20s，自然风干备用。
　　2.nCS的制备:用离子交联法[31]制备nCS:将20mgCS溶于20ml1％的冰醋酸溶液中，室温下磁力搅拌至完全溶解后，用10M-NaOH调节PH至4.6-6.0，然后再在磁力搅拌下将5ml浓度为1mg/ml的多聚磷酸钠溶液，逐滴滴入壳聚糖溶液中（约15s/滴），待溶液呈淡蓝色时，15，000rpm/min离心15 min，去上清，沉淀部分用去离子水清洗三次并重悬后，超声混匀处理20s，自然风干备用。
　　3.特征:分别取nPLGA、nCS悬液适量，用Malvern Zetasizer3000HS仪分别测定纳米粒的粒径及表面电位;分别将适量nPLGA、nCS悬液滴于铜网上，静置2min后用镊子夹起铜网，并用滤纸吸去多余液体;室温下干燥后，置于透射电镜下观察并进行拍照。
　　第二章 nPLGA、nCS和nAg的生物学特性
　　1.人牙周膜细胞的培养:取12-24周岁志愿者（知情同意）因正畸或阻生拔除的无龋、无牙周炎的正畸牙或阻生牙，刮取牙周膜组织，冲洗、剪碎、消化，改良组织块酶消化法培养，待细胞饱和达80％时，按1∶2-3的比例传代培养，3-5代人牙周膜细胞用于实验。
　　2.细胞毒性与增殖:实验分为3大组:nPLGA组、nCS组和nAg组;nPLGA组包括空白对照组、1mg/mlPLGA粉末组、0.5mg/ml nPLGA组、1mg/ml nPLGA组和2mg/ml nPLGA组5个亚组;nCS组分为空白对照组、1mg/ml CS粉末组、0.5mg/ml nCS组、1mg/ml nCS组和2mg/ml nCS组5个亚组;nAg组分为2μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml和50μg/ml5个亚组。以1-5×103个/孔浓度接种96孔板，24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。
　　3.茜素红染色:经nPLGA、nCS处理的牙周膜细胞成骨诱导21day，茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。
　　4.qRT-PCR实验:牙周膜细胞经成骨诱导21day后，qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因（OCN、ALP和OPN）的表达。
　　5.抑菌实验:采用平板菌落计数法检测nPLGA、nCS和nAg对大肠杆菌的抑菌作用。
　　第三章 nPLGA、nCS与nAg混合物的制备及生物学特性初步鉴定
　　实验一 nPLGA、nCS混合物的生物学特性初步鉴定
　　1.细胞毒性与增殖:nPLGA与nCS以9∶1、8∶2、7∶3的比例与牙周膜细胞混合培养，于24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。
　　2.茜素红染色:牙周膜细胞成骨诱导21day，茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。
　　3.qRT-PCR实验:牙周膜细胞经成骨诱导21day后，qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因（OCN、ALP和OPN）的表达。
　　实验二 nPLGA、nCS与nAg混合物的生物学特性初步鉴定
　　1.细胞毒性与增殖:根据以上实验选择合适比例的nPLGA和nCS以及适当浓度的nAg，实验分为空白对照组、nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组，于24h、48h和72h检测牙周膜细胞的毒性，1d、2d、3d、5d和7d检测牙周膜细胞的增殖。
　　2.茜素红染色:牙周膜细胞成骨诱导21day，茜素红染色后倒置显微镜下观察矿化结节的形成。
　　3.qRT-PCR实验:牙周膜细胞经成骨诱导21day后，qRT-PCR测试牙周膜细胞成骨相关基因(OCN、ALP和OPN)的表达。
　　4.nPLGA/nCS/nAg混合物的抑菌性:nPLGA、nCS和nAg抑菌浓度均设为800μg/ml，实验分为nPLGA、nCS、nAg、nPLGA/nCS、nPLGA/nAg、 nCS/nAg和nPLGA/nCS/nAg组。
　　结果：
　　1.成功制备nPLGA和nCS
　　透射电镜观察显示:nPLGA呈球形，nCS形态类似球形，纳米粒大小较均匀，形态规则，边缘清晰。
　　2.nPLGA、nCS和nAg的生物学特性
　　nPLGA、nCS和nAg对人牙周膜细胞的相对增殖率均在80％以上，根据ISO10993-5，可以认为nPLGA、nCS和nAg对人牙周膜细胞无毒性。nPLGA、nCS和PLGA、CS粉末一样对人牙周膜细胞的增殖无影响，且各组均与空白对照组无统计学差异(p＜0.05）。nAg当浓度小于40μg/ml，对人牙周膜细胞的增殖无影响(p＜0.05）;但当浓度不小于40μg/ml时，在第5d细胞的OD值低于空白对照组，且与空白对照组有统计学差异(p＞0.05）。
　　nPLGA和PLGA粉末对大肠杆菌无抑菌作用。nCS和CS对大肠杆菌的抑菌作用随着浓度的增加逐渐增加。对于nCS组，0.8mg/ml组抑菌率低于2mg/ml和5mg/ml组的抑茵率，并且具有统计学差异(p＜0.05），其余各浓度组间无差异(p＞0.05)。对于CS粉末组，各浓度组与5mg/ml浓度组均有统计学差异(p＜0.05），其余各组间无统计学差异(p＞0.05）。相同浓度的nCS的抑菌率比CS粉末的抑菌率高，且当浓度不大于2mg/ml时，nCS的抑菌率明显高于CS粉末组，两组间的抑菌率具有统计学差异(p＜0.05）。
　　3.nPLGA、nCS和nAg混合物的制备和生物学特性
　　nPLGA和nCS混合物对牙周膜细胞的相对增殖率均在95％以上，根据ISO10993-5 nPLGA和nCS混合物对牙周膜细胞无毒性。经nPLGA和nCS混合物处理的牙周膜细胞的OD值随时间的增加也不断增加，且与空白组无明显差异(p＞0.05)。
　　nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞的相对增殖率均在95％以上，根据ISO10993-5 nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞无毒性。细胞的OD值随时间的增加不断增加，组间无统计学差异(p＞0.05)。
　　nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组茜素红染色颜色较空白组较深，且矿化结节也较空白组明显，两者间颜色和矿化结节无明显差异。nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组OCN、OPN的表达明显高于空白组，且与空白组有统计学差异(p＜0.05);两者间未发现有差异;ALP的表达PLGA/CS/nAg组稍高于空白组，但未发现组间有差异;nPLGA/nCS/nAg组和PLGA/CS/nAg组间OCN、ALP、OPN的表达未发现有统计学差异。
　　nPLGA对nCS和nAg的抑菌性无影响，且当nCS和nAg的浓度为0.8mg/ml时，未发现两者对彼此的抑菌性有影响。
　　结论：
　　1.成功制备nPLGA、nCS，纳米粒大小较均匀，形态规则，边缘清晰。
　　2.nPLGA、nCS和PLGA、CS粉末一样，拥有较好的生物相容性，对人牙周膜细胞无毒性且不影响人牙周膜细胞的增殖。当nAg浓度不大于50μg/ml时，对人牙周膜细胞无毒性，但浓度大于等于40μg/ml，会对人牙周膜细胞的生长产生抑制作用。nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg对牙周膜细胞无毒性，对牙周膜细胞的增殖无影响。
　　3.nCS和CS对大肠杆菌均有较强的抑菌效果，但浓度低时，nCS的抑菌效果明显比CS强。nAg对大肠杆菌具有较好的抑菌性，浓度为400μg/ml时抑菌率就已超过50％。nPLGA和PLGA对大肠杆菌均无抑菌性，而且nPLGA对nCS和nAg的抑菌性无影响。
　　4.PLGA、CS粉末和nPLGA、nCS均在一定程度上促进了膜细胞的矿化能力。
　　nPLGA/nCS/nAg和PLGA/CS/nAg在一定程度上促进了牙周膜细胞的矿化能力。

目录

摘要

前言

第一章 nPLGA、nCS的制备及物理学特征

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第二章 nPLGA、nCS和nag的生物学特性初步分析

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

第三章 nPLGA、nCS与nAg混合物的制备及生物学特性初步分析

实验一 nPLGA、nCS混合物的生物学特性初步分析

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

实验二 nPLGA、nCS与nAg混合物的生物学特性初步分析

1．材料与方法

2．结果

3．讨论

全文总结

参考文献

攻读硕士期间主要成果

致谢

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