不同年龄阶段家兔跟腱经皮切断愈合后的生物力学和组织学研究

摘要

背景:
　　先天性马蹄内翻足（congenital clubfoot，CCF）是儿童常见的先天性足部畸形，新生儿发病率为0.1％，在中国发病率为0.039％，男孩是女孩的2倍。主要表现为前足内收内翻、跟骨内翻、后足马蹄畸形以及胫骨远端继发性内旋，是导致儿童致残的重要原因。目前，国际上公认的早期保守治疗先天性马蹄内翻足的有效方法是Ponseti方法，其治疗成功率超过90％，目标是获得外观正常、无痛、跖行、柔软的足。主要通过早期手法矫正、连续石膏矫形固定、经皮跟腱切断术以及佩戴足外展矫形支具来矫正系列畸形。其中，经皮跟腱切断(percutaneousAchilles tenotomy，PAT)是Ponseti方法中重要组成部分，用于纠正治疗后残留的马蹄畸形，保护足弓的正常发育，是一项简单、安全、微创的手术技术，约90％CCF患儿须行经皮跟腱切断术。与传统广泛软组织松解相比较，行跟腱切断术后，患足未出现僵硬表现。Ponseti在其长达几十年的临床观察和疗效显示CCF患儿行经皮跟腱切断后跟腱可恢复其连续性和完全愈合，未出现再断裂的风险，并且4岁以内CCF患儿可重复行经皮跟腱切断术治疗。这表明经皮跟腱切断术在Ponseti方法中的重要性。
　　虽然，经皮跟腱切断术是一项简单、安全、微创的手术技术，但是许多临床医生仍担心跟腱完全离断后无法获得完美的愈合效果，从而影响足踝部功能，给患儿造成极大的疼苦，因此不愿选择经皮跟腱切断术纠正残留的马蹄畸形。尤其是对于年龄超过4岁的大龄CCF患儿，医生常常首选开放的跟腱延长术，并行断端缝合，其认为这种术式可减少术后再断裂的风险，提高跟腱的力学强度。但是，由于跟腱解剖结构的特殊性，开放手术过分剥离腱周软组织，破坏了跟腱的血供，增加了其感染坏死的风险。此外，Ponseti也没有详细研究和明确报道该手术技术适合的年龄范围，这也阻碍了Ponseti方法在发展中国家的应用和推广。
　　因此，明确行经皮跟腱切断术年龄对跟腱愈合影响以及愈合后力学性质，为大龄CCF患儿的临床治疗和术式的选择提供依据具有非常重要的意义。
　　目的:
　　通过建立PAT动物模型，从生物力学和组织学方法研究跟腱愈合情况及功能;观察不同年龄家兔PAT后跟腱愈合情况，探讨跟腱愈合与年龄因素的关系;结合临床，提高行PAT后CCF患者跟腱的功能。
　　方法:
　　1、动物分组
　　SPF级普通级不同年龄阶段新西兰家兔48只，雌雄不限，按照其年龄分为4组，分别为group2，group4，group8，group12，每组12只，每个年龄阶段组体重相同。每组再随机均分为2个小组，作为实验组和对照组，以A代表实验组，B代表对照组，各组标为group2A/group2B，group4A/group4B，group8A/group8B，group12A/group12B，每小组各6只。
　　2、动物模型制作
　　选取各年龄组中groupA组家兔，固定四肢，置于俯卧位。双腿术野处剪毛，洗必泰酒精消毒皮肤，术前行利多卡因0.1ml局部麻醉，无菌条件下选用5号注射器针头于家兔双侧后肢跟腱止点上1cm处内侧行经皮跟腱切断术，跟腱完全离断后，生理盐水充分冲洗伤口3次，不缝合伤口，无菌纱布包扎，长腿管型石膏固定踝关节于中立位4周，术后单笼饲养，无需使用抗生素预防性感染。动物饲养于南方医院动物实验中心，单笼饲养，自由进食，室温控制在25℃+0.5℃，湿度60％，定期紫外线消毒与排风。
　　3、干预方法
　　术后单笼饲养，自由进食，4周后拆除石膏。
　　4、标本观察
　　观察家兔日常活动，后肢活动，术后4周拆除石膏，观察伤口情况，跟腱连续性等一般情况。术后16周取跟腱标本对比各组内group A组和groupB组跟腱长度和横径大小，并制作石蜡切片行HE染色，同时在正置显微镜下察看跟腱组织新生毛细血管、成纤维细胞形态、结构及排列等情况。
　　5、指标测量
　　术后第16周取groupA组和groupB组跟腱标本，去除腱周组织，置于0摄氏度生理盐水冰水中保存，在恒定的室温下进行跟腱最大抗拉伸强度测定。通过软件分析跟腱生物力学特性。
　　6、统计学处理
　　采用IBM SPSS20.0进行数据分析，计量资料用均数±标准差的方式表示，总体比较采用2*2的析因设计的方差分析，组间多重比较采用LSD法。组内多组比较采用单因素方差分析方法，两组比较采用两样本独立T检验。
　　结果:
　　1、标本外观
　　术后各组家兔存活至实验完成，后肢活动良好。术后第4周拆除石膏，伤口均未见感染。4周龄、8周龄、10周龄、12周龄家兔皮肤伤口处愈合良好，跟腱均愈合。groupA组于跟腱处均可触及连续、条索状结构，质韧，与健侧相比明显较细，其中groupA组足背伸活动度较groupB组明显偏大。术后第16周各组跟腱基本愈合，各group A组可触及连、条索状结构，质韧，较健侧稍细。离体跟腱标本中，各groupA组跟腱长度较groupB组长约1cm，手术组跟腱横径较非手术组较小。手术组跟腱与腱周膜有轻微粘连。
　　2、HE染色
　　1.术后16周，HE染色显示group2A组标本跟腱组织整体连续、完整，纤维编织呈条索状，排列较紧密，轻微皱褶、杂乱，纤维细胞呈长椭圆形，纵向生长，有大量成熟成纤维细胞，细胞核呈梭形，周围可见少量炎性细胞及红细胞浸润，有少量新生毛细血管生成。腱周膜连续，表面轻微粗糙，不光滑。
　　group2B组标本显示跟腱组织整体连续完整，肌腱纤维组织分布均匀，排列紧密有序、纤维细胞呈椭圆形，细胞核呈梭形。腱周膜连续光滑。
　　2.术后16周，group4A组显示跟腱组织整体连续完整，肌腱纤维组织编织呈条索状，有轻微皱褶，纤维间排列紧密，有轻微杂乱，纤维细胞呈长椭圆形，纵向生长，大量成熟成纤维细胞，细胞核呈梭形，可见少新生毛细血管生成，有炎性细胞及红细胞浸润。腱周膜连续，轻微粗糙。
　　group4B组低倍镜下见见跟腱组织整体连续完整，肌腱纤维组织排列紧密有序、纤维细胞呈椭圆形。腱周膜连续，光滑。
　　3.术后16周，group8A组显示跟腱组织整体连续完整，纤维编织呈条索状，有明显皱褶，成纤维细胞数目较少，细胞核呈长条形。肌腱纤维组织排列明显杂乱、疏松，纤维间有明显空隙，有新生毛细血管生成和炎性细胞及红细胞浸润。腱周膜连续，表面较粗糙，不光滑。
　　group8B组显示跟腱组织整体连续完整，肌腱纤维组织排列紧密有序，纤维细胞分布均匀，呈椭圆形。腱周膜连续，光滑。
　　4.术后16周，group12A组显示跟腱组织整体连续完整，纤维排列疏松，可见有空隙，纤维编织呈条索状，皱褶明显，肌腱纤维组织排列杂乱、疏松，纤维间空隙较大，肌腱纤维细胞数目较少，细胞核成长条形，有大量新生毛细血管生成，有炎性细胞及红细胞浸润。腱周膜连续，表面较粗糙，不光滑。
　　group12B组显示跟腱组织整体连续完整，见肌腱纤维组织排列紧密有序、纤维细胞呈椭圆形。腱周膜连续、光滑。
　　3、生物力学测试:
　　术后16周，不同年龄组间有显著差异(F=97.842，p=0.000)，不同分组间有显著差异(F=2105.073，p=0.000)，年龄和分组间存在交互效应(F=472.916，p=0.000)，年龄组两两比较结果，各年龄组间差异均有统计学意义(p＜0.05);在对照组和实验组中，年龄组的组间比较均有统计学差异;且2周龄、4周龄、8周龄、12周龄组内groupA组和groupB组间差异有统计学意义。
　　结论:
　　1.在家兔PAT模型中，所有断裂跟腱术后4周均可恢复连续性;
　　2.在家兔PAT模型中，年龄越小断裂跟腱修复愈合速率越快，组织结构和力学强度恢复越好.

目录

摘要

前言

一、材料与方法

1．1 实验动物

1．2 实验主要器材

1．3 实验主要试剂

1．4 动物分组

1．5 动物模型制作

1．6 干预方法

1．7 标本获取

1．8 观察指标

1．9 统计学处理

二、结果

2．1 一般情况

2．2 组织学观察

2．3 生物力学试验

三、讨论

四、结论

参考文献

综述1 急性跟腱断裂的治疗进展

综述2 基于力学生物学的跟腱愈合研究现状

中英文缩略词对照表

攻读硕士学位期间成果

致谢

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