二氢辣椒碱通过抑制Foxa2和增强LXRα下调HepG2细胞中apoM的表达

摘要

背景:
　　二氢辣椒碱(dihydrocapsaicin，DHC)和辣椒素(capsaicin)占红辣椒提取物中辣椒素类物质的85-90％。已证实DHC可以加速人和啮齿类动物碳水化合物代谢、能量消耗和脂质代谢，且已成功用于治疗和缓解一些临床症状，如周围神经炎引起的疼痛、类风湿性关节炎和骨关节炎等。有研究表明定期摄入红辣椒可以在体外增加脂蛋白的抗氧化能力和在体内调节餐后高胰岛素血症等情况，这些机体的变化提示DHC可能有助于降低心血管疾病(cardiovasculardiseases，CVD)的风险。Adam等研究发现DHC和capsaicin可以在体外抑制血小板的聚集和凝血因子Ⅷ和Ⅸ的活化，可能有助于抑制动脉血栓的形成和防治心血管疾病。此外，我们课题组研究表明，DHC可通过PPARγ/LXRα途径抑制高脂饮食的apoE-/-小鼠主动脉粥样斑块的形成，这些结果提示DHC与心血管疾病，特别是动脉粥样硬化的防治密切相关。
　　载脂蛋白M(apoliproteinM，apoM)属于Lipocalin蛋白超家族成员，主要由肝脏及肾脏组织产生。肝脏中的apoM主要存在于肝细胞，绝大部分肝脏中的apoM分泌入血浆并整合到脂蛋白中，对apoM在血浆脂蛋白中分布的研究发现，绝大部分apoM分布在高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）中(96％apoM存在于HDL)，极少数的apoM也存在于低密度脂蛋白(Low densitylipoprotein，LDL)、极低密度脂蛋白(Very low density lipoprotein，VLDL)和甘油三酯(Triglyceride，TG)等脂蛋白中。研究表明，apoM在Preβ-HDL的形成和细胞内胆固醇流出至HDL中起着重要作用，采用RNA干扰技术将小鼠apoM基因沉默后，小鼠肝脏和血浆中apoM的表达减少，apoM表达减少后可以导致血浆中Preβ-HDL缺失，使得血浆中HDL的浓度降低。
　　转录因子叉头框蛋白A2(forkhead box A2，Foxa2)，基因定位于染色体20p11.21，是参与肝脏葡萄糖稳态和脂质代谢的转录因子。Foxa2在低胰岛素水平时定位于细胞核并可转录激活诱导脂肪酸氧化和酮体生成相关基因的转录和促进VLDL的分泌以及胆汁酸的代谢。当血浆胰岛素水平升高时，激活胰岛素受体，Foxa2发生磷酸化反应且从细胞核中排出，其转录活性受到抑制。已有研究表明，转录因子Foxa2与apoM启动子的结合位点在-474。
　　肝X受体(Liver X Receptor，LXR)是胆固醇代谢的主要转录因子，LXRα主要在脂质代谢活跃的组织如白脂肪组织、肝脏、小肠、脾、脑垂体和巨噬细胞中表达，可参与调节脂质的代谢平衡。Zhang等研究发现apoM基因是受LXRα调控的靶基因之一，LXR激动剂TO901317在体内外均能显著降低apoM的表达，进一步研究发现，用TO901317处理小鼠后，小鼠血浆中apoM表达水平明显降低。相同的是，在HepG2细胞培养过程中加入TO901317也会下调apoM的表达。
　　但是，DHC是否可影响apoM的表达及其相关作用机制尚未见相关文献报道，Foxa2和LXRα是否参与DHC调控apoM的表达尚不清楚。本研究发现。DHC可通过抑制Foxa2和增强LXRα下调HepG2细胞中apoM的表达。
　　方法:
　　1、DHC的配制
　　DHC为脂溶性物质，溶于无水乙醇溶液中，配置成初浓度为1mol/L的储存液，接着用无菌生理盐水按不同浓度要求0、25、50、100uM进一步溶解稀释，最终DHC的工作液中乙醇浓度为0.1％，同时以等体积的含有0.1％乙醇的生理盐水作为空白对照处理细胞，工作液都是在处理细胞前现配现用。
　　2、细胞培养
　　HepG2细胞生长于含有10％胎牛血清的高糖DMEM培养液中，37℃、5％CO2恒温细胞培养箱中静置培养。培养过程中加入1％100 U/ml的青霉素和100μg/mL的链霉素，每隔2～3天传代一次，取对数生长期细胞进行实验。细胞接种在6孔板或12孔板中，待其生长到汇合度达60-80％进行处理。
　　3、实验动物
　　8周龄的雌性C57BL/6小鼠10只，均重20g，随机分为2组，每组5只:(1)对照组，用不含胆固醇的植物油灌胃处理（0.2 ml/只），1次/天;(2) DHC处理组，用溶解有DHC的无胆固醇的植物油灌胃处理（0.2 ml/只，按DHC3.0mg/kg的剂量），1次/天。饲养条件为每笼5只，室温25℃，正常饲料饲喂并给予每12小时光照/黑暗循环。1周后，对动物进行麻醉，颈椎脱臼法处死小鼠后分离肝脏组织进行后续实验。
　　4、RNA提取和实时荧光定量PCR
　　TRIzol试剂盒提取培养细胞和小鼠肝脏组织的总RNA，将1μg总RNA用逆转录试剂盒反转录成20μl cDNA。实时定量PCR在ABI7500FAST上进行，溶解曲线分析表明PCR反应是否特异，以GAPDH表达量为内参并以△ACt方法定量mRNA的相对表达量。
　　5、免疫印迹(Western blot analyses)
　　蛋白提取试剂盒提取细胞及小鼠肝脏组织的蛋白，对蛋白提取物定量后向蛋白提取物中加入5X的SDS，混匀并煮沸10分钟，冷却后置冰箱待用。10％琼脂糖凝胶电泳分离目的蛋白，按说明书要求依次电泳、转膜、封闭后以兔多克隆抗APOM、Foxa2、LXRα和β-actin一抗孵育过夜，洗涤孵育二抗再洗涤后，以化学发光法显示条带，检测目的蛋白的相对表达量。
　　结果:
　　1、DHC可浓度和时间依赖性减少HepG2细胞中apoM基因和蛋白的表达水平。
　　ApoM主要在肝细胞及肾小管上皮细胞中表达，肝细胞合成的apoM可分泌入血，与血浆中的脂蛋白结合，血浆中96％的apoM存在于HDL。我们首先检测DHC对HepG2细胞中的apoM表达的影响，用0、25、50、100uM DHC分别处理HepG2细胞24小时，荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的apoM mRNA和蛋白的表达水平;用100uM DHC处理HepG2细胞后0、6、12、24h检测apoM基因和蛋白的表达水平，荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可时间依赖性减少HepG2细胞中的apoMmRNA和蛋白的表达。
　　2、Foxa2参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。
　　以往研究表明，Foxa2是一种参与肝脏葡萄糖代谢的转录因子，apoM受Foxa2的直接调控，因此我们检测Foxa2是否参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表达。接着我们采用小分子RNA干扰技术敲减HepG2细胞的Foxa2，Foxa2表达量减少了87％。Foxa2 siRNA处理HepG2细胞后，DHC抑制apoM表达的效应更加显著;相反，用重组的Foxa2质粒过表达HepG2细胞后，Foxa2表达量增加了565％。Foxa2重组质粒处理HepG2细胞的Foxa2后，DHC抑制apoM表达的效应被部分抵消。
　　3、DHC通过增加LXRα来下调HepG2细胞中apoM的表达。
　　已有研究表明，用LXR激动剂TO901317处理HepG2细胞后，apoM mRNA表达水平显著下调，且TO901317处理小鼠后，小鼠血浆中apoM表达水平也出现明显降低。因此我们检测LXRα是否参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调。荧光定量PCR与免疫印迹的结果显示DHC可浓度依赖性增加HepG2细胞中的LXRα mRNA和蛋白的表达。采用小分子RNA干扰技术敲减HepG2细胞的LXRα后，LXRα表达量减少了91％，免疫印迹的结果显示LXRαsiRNA处理后DHC抑制apoM的表达被部分逆转;相反，用重组的LXRα质粒处理HepG2细胞后，LXRα表达量增加了617％，过表达LXRα后DHC抑制apoM表达的效应更加明显。
　　4、DHC可下调小鼠肝脏组织apoM的表达。
　　肝脏是主要产生和降解血液循环中含apoM脂蛋白的组织器官，我们在体外实验已证实，DHC可以通过抑制Foxa2和增强LXRα来减少HepG2细胞中的apoM基因和蛋白的表达，因此我们下一步检测DHC对C57BL/6小鼠肝组织apoM、Foxa2和LXRα的影响。
　　结论:
　　1、DHC可浓度和时间依赖性减少HepG2细胞中apoM基因和蛋白的表达水平。
　　2、DHC可浓度依赖性减少HepG2细胞中的Foxa2 mRNA和蛋白的表达，采用RNA干扰技术敲减Foxa2后，DHC抑制apoM表达的效应更加显著;过表达Foxa2后，DHC抑制apoM表达的效应被部分抵消。
　　3、DHC可浓度依赖性增加HepG2细胞中的LXRα mRNA和蛋白的表达，采用RNA干扰技术敲减LXRα后，DHC抑制apoM的表达被部分逆转;过表达LXRα后，DHC抑制apoM表达的效应更加明显。
　　4、DHC灌胃处理C57BL/6小鼠后，肝脏apoM的表达减少、LXRα表达增加并且Foxa2表达减少。

目录

摘要

前言

材料和方法

1．实验材料

2．主要溶液的配制方法

3．实验方法

实验结果

1、DHC可减少HepG2细胞中的apoM mRNA和蛋白的表达水平

2 Foxa2参与DHC介导的HepG2细胞中apoM的表达下调

3 DHC通过增加LXRα来下调HepG2细胞中apoM的表达

4 DHC对小鼠肝脏组织apoM表达的影响

讨论

参考文献

全文小结

英文缩写词一览表

综述 载脂蛋白M的研究进展

攻读学位期间成果

致谢

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