MiR-29b对HER2过表达型乳腺癌生长与侵袭的作用及机制研究

摘要

目的:
　　乳腺癌(Breast cancer，BC)是女性最常见的恶性肿瘤之一。乳腺癌的分子分型是根据雌/孕激素受体(ER/PR)、人表皮生长因子受体2（HER2）及增殖细胞核抗原Ki-67，乳腺癌可分为以下几种分型:管腔型，即luminal型，包括luminalA型和luminal B型;HER2过表达型和三阴型。研究已经证实，乳腺癌的分子病理进程涉及多种微小RNA（microRNAs，miRNAs）的异常表达。
　　目前尚无miR-29b在HER2过表达型乳腺癌中功能和作用机制的研究，因此在本研究中我们将关注miR-29b对HER2过表达型乳腺癌恶性生物学行为的影响，探索其发挥作用的机制，这可能为HER2过表达型乳腺癌患者的诊断和治疗提供新的思路和靶点。
　　方法:
　　一、MiR-29b在乳腺癌组织中的表达及其临床意义
　　1.乳腺癌组织、癌旁组织标本及临床病理资料的收集
　　收集2012.11-2013.11南方医院手术切除的乳腺癌组织标本和癌旁组织标本67例，肿瘤组织经临床病理检查诊断均为原发性乳腺癌。配对的癌旁组织取自距离肿瘤组织边缘5cm。组织标本用10％福尔马林固定，石蜡包埋。患者在手术切除肿瘤前未接受过局部或者系统治疗。
　　2.肿瘤组织与癌旁组织中MiR-29b的检测
　　应用QIAGEN公司miRNeasy FFPE KIT提取石蜡组织标本中的总RNA，运用实时荧光定量PCR法检测miR-29b表达量。
　　3.癌组织miR-29b表达水平的判定
　　实时荧光定量PCR实验重复三次，采用相对定量法计算组织miR-29b表达水平:肿瘤组织(Cancer，C)和癌旁组织(Normal，N)各取平均Ct值，以U6 snRNA作为内参，计算两组的2-ΔΔCt值;以U6 snRNA和癌旁组织作为对照，计算肿瘤组织相对与癌旁组织的相对表达量(C/N)，数据经log10转换，当＜0时定义为表达下降;当≥0定义为表达升高。
　　二、上调miR-29b表达对HER2过表达型乳腺癌细胞增殖和侵袭的影响
　　细胞株检测中发现HER2过表达型乳腺癌细胞株MDA-MB-435和SK-BR-3中miR-29b的表达水平较正常乳腺上皮细胞和其他表型乳腺癌细胞均显著降低，选择这两株细胞进行下一步的细胞学实验。
　　1.细胞株的培养条件
　　人乳腺癌细胞株SK-BR-3细胞选用McCoy'5a培养基+10％胎牛血清+1％双抗，MDA-MB-435选用DMEM培养基（高糖）+胎牛血清10％+1％的双抗，置于37℃，5％ CO2，95％湿度培养箱中培养。
　　2.MiR-29b mimics转染MDA-MB-435及SK-BR-3细胞
　　使用Lipofectamine2000转染乳腺癌细胞株，miR-29b mimics的最终转染浓度为50nm，转染后通过荧光定量PCR法检测是否过表达成功。
　　3.上调miR-29b表达对MDA-MB-435及SK-BR-3细胞增殖及侵袭的影响
　　转染miR-29b mimics之后，经CCK-8实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术检测细胞周期及细胞凋亡及裸鼠皮下移植瘤实验，观察miR-29b在体内外对HER2过表达型乳腺癌增殖、细胞周期和凋亡及侵袭能力的影响。
　　三、MiR-29b下游靶基因的预测和确定及其对STAT3调控作用的研究
　　1.构建野生型STAT33'UTR（STAT3_WT）和突变型STAT33'UTR(STAT3_MUT)质粒。
　　2.双荧光素酶活性检测:miR-29b mimics/scramble与质粒共转染两株乳腺癌细胞，48小时后检测双荧光素酶活性变化。
　　3.通过荧光定量PCR法检测MDA-MB-435和SK-BR-3细胞转染MiR-29bmimics/scramble后STAT3 mRNA的变化。
　　4.使用Western-blot法检测转染miR-29b mimics后，MDA-MB-435和SK-BR-3细胞内STAT3蛋白表达量的变化。
　　四、STAT3参与miR-29b介导的对HER2过表达型乳腺癌细胞生物学特性的影响
　　1.细胞株的培养条件
　　SK-BR-3和MDA-MB-435培养条件同前所述。
　　2.si-STAT3/control转染MDA-MB-435及SK-BR-3细胞
　　使用Lipofectamine2000转染乳腺癌细胞株，转染后通过荧光定量PCR检测STAT3 mRNA、Western-blot法检测STAT3蛋白水平，验证siRNA是否成功敲低STAT3。
　　3.下调STAT3表达对HER2过表达型乳腺癌细胞增殖及侵袭的影响
　　转染si-STAT3/control之后，经CCK-8实验、Transwell细胞侵袭实验、流式细胞术细胞周期及细胞凋亡实验，观察两不同处理组乳腺癌细胞增殖、侵袭、细胞周期和凋亡的变化情况。
　　4.Rescue实验（靶标蛋白回复实验）进一步证实HER2过表达型乳腺癌中miR-29b对STAT3的直接调控作用
　　五、MiR-29b对STAT3及其下游信号分子表达的影响
　　Western-blot法分别检测转染si-STAT3/control和miR-29b mimic/scramble的两株细胞中STAT3及其下游信号分子的蛋白表达情况。免疫组化检测两个不同处理组（miR-29b mimic/scramble转染组）裸鼠瘤块中STAT3与HER2的表达情况。
　　结论:
　　一、与癌旁正常组织相比，miR-29b在乳腺癌患者肿瘤组织中的表达水平显著下降，其表达水平与肿瘤大小、HER2的表达状态相关，肿瘤最大径≥5cm、HER2阳性是乳腺癌患者miR-29b表达量降低的独立危险因素;所有分子分型中，miR-29b在HER2过表达型患者中的表达水平最低，提示miR-29b在乳腺癌尤其是HER2过表达型乳腺癌中可能发挥抑癌功能。
　　二、与正常乳腺细胞和其他分子分型乳腺癌细胞相比，MiR-29b在HER2过表达型乳腺癌细胞SK-BR-3及MDA-MB-435中的表达水平显著降低，与组织学检测结果一致，过表达miR-29b在体内外均能抑制HER2过表达型乳腺癌细胞的生长。
　　三、HER2过表达型乳腺癌中，STAT3是miR-29b的靶基因，miR-29b能与STAT3 mRNA3'UTR区互补结合，在mRNA和蛋白两个水平负向调控STAT3表达。
　　四、敲低STAT3和过表达miR-29b取得的生物学效应一致，均可以抑制HER2过表达型乳腺癌的生长，在过表达miR-29b的细胞内恢复STAT3的表达可以部分逆转miR-29b的抑癌功能，说明在HER2过表达型乳腺癌中，miR-29b是直接调控STAT3发挥抑癌功能的。
　　五、miR-29b通过靶向调控STAT3影响其下游信号分子MMP-2、CCND2及HER2的表达，发挥抑制HER2过表达型乳腺癌恶性生物学行为的功能。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 MiR-29b在乳腺癌组织中的表达及其临床意义

1．1 主要仪器和耗材

1．2 方法

1．3 实验结果

1．4 讨论

参考文献

第二章 HER2过表达型乳腺癌中miR-29b的表达及其对肿瘤生物学行为的影响

2．1 主要仪器设备和耗材

2．2 实验方法

2．3 统计学方法

2．4 实验结果

2．5 讨论

参考文献

第三章 MiR-29b下游靶基因的预测和确认及其对靶基因STAT3调控作用的研究

3．1 主要仪器设备和耗材

3．2 实验方法

3．3 统计学方法

3．4 实验结果

3．5 讨论

参考文献

第四章 STAT3参与miR-29b介导的对HER2过表达型乳腺癌生物学特性的影响

4．1 主要仪器设备和耗材

4．2 实验方法

4．3 统计学方法

4．4 实验结果

4．5 讨论

参考文献

第五章 MiR-29b对STAT3及其下游信号分子表达的影响

5．1 主要仪器设备和耗材

5．2 实验方法

5．3 统计学方法

5．4 实验结果

5．5 讨论

参考文献

全文小结

英文缩略词表

攻读博士学位期间成果

致谢

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统计学证明