Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用的实验研究

摘要

研究背景:
　　基于Dectin-1在抗曲霉免疫中的重要作用和腺病毒载体基因治疗的广泛应用。本研究通过气管内注射给药的方式将Dectin-1重组腺病毒载体投送至小鼠肺部以构建Dectin-1气道上调表达小鼠模型，通过免疫组化及Real-timePCR技术验证Dectin-1表达，并对给予载体后安全性进行评价。同时，进一步研究Dectin-1重组腺病毒载体在烟曲霉感染中的作用，并通过测定炎症因子、组织病理、真菌负荷、生存时间等方面评价其免疫保护作用。
　　第一部分Dectin-1重组腺病毒小鼠体外表达模型的鉴定及安全性研究
　　目的:
　　采用气管内注射给予Dectin-1重组腺病毒的方法建立气道Dectin-1上调表达小鼠模型，进一步验证模型和评价其安全性。
　　方法：
　　BALB/c小鼠分为PBS组、Ad-EGFP(recombinant adenovirus encodingenhanced green fluorescent protein)组、 Ad-mDectin-1(recombinantadenovirus encoding murine Dectin-1)组，分别经气管给予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS组及Ad-EGFP组为对照组。在给药后第3d，通过Real-time PCR检测各组肺组织Dectin-1 mRNA水平，通过免疫组化检测各组肺组织Dectin-1蛋白分布及表达水平，通过ELISA检测各组肺组织匀浆及血液中白细胞介素(IL)-6水平，通过激光共聚焦检测腺病毒载体在肺组织及肝脏的分布情况。继续通过免疫组化检测在给药后第5、7、14d各组肺组织Dectin-1水平变化。通过Image-Pro Plus6.0分析气管壁Dectin-1积分光密度变化情况。
　　结果：
　　通过采用气管内给药方式，在第3d可以观察到Ad-mDectin-1组小鼠肺组织Dectin-1 mRNA水平约为PBS组、Ad-EGFP组的18倍。Ad-mDectin-1组与对照组比较差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.012;Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.011）。对照组之间比较差异无统计学意义(P=0.994)。在经气道给药后第3、5、7、14d，Ad-mDectin-1组可观察到Dectin-1主要定位于细支气管，可见棕黄色阳性颗粒位于胞浆及胞膜。而肺泡上皮未发现明显阳性颗粒沉着。对照组均未见肺上皮细胞有棕黄色阳性颗粒沉着。在Ad-mDectin-1组中可以观察到Dectin-1水平逐渐增高，在第5d达高峰，第14d气道上皮细胞仍有Dectin-1表达。通过Image Pro Plus6.0软件进行分析发现，平均光密度值从第3d开始上升，并在第5d达高峰，第14d明显下降。各时间点比较发现第5、7d与第3、14d比较差异有统计学意义（第5、7d vs第3、14d，P＜0.001）。在给药后第3d，通过激光共聚焦显微镜观察Ad-mDectin-1在全身的分布情况。结果显示在肺组织中Ad-mDectin-1组及Ad-EGFP组均可发现绿色荧光，而PBS组肺组织未见绿色荧光。在肝脏组织中，各组均未发现绿色荧光蛋白。肺组织及血清中IL-6水平显示，Ad-mDectin-1组IL-6水平较PBS及Ad-EGFP对照组无明显差异（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.875;Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.598）。同时检测血清中IL-6水平未见明显变化。
　　结论：
　　通过气管内给予Ad-mDectin-1成功上调小鼠肺组织Dectin-1水平，Dectin-1主要表达于细支气管上皮细胞，表达高峰在第5d，可持续2w以上。同时给予Ad-mDectin-1后对小鼠生存和活动无明显影响，未造成明显炎症反应及远隔器官肝脏的播散。
　　第二部分Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病的免疫保护作用
　　目的：
　　通过预先给予Dectin-1重组腺病毒，研究其对小鼠侵袭性肺曲霉病的免疫保护作用。
　　方法：
　　BALB/c小鼠分为PBS组、Ad-EGFP组、Ad-mDectin-1组，分别经气管给予PBS、Ad-EGFP、Ad-mDectin-1。PBS组及Ad-EGFP组为对照组。1d后经腹腔注射环磷酰胺构建免疫缺陷小鼠，4d后建成免疫缺陷小鼠模型，此时经气管给予3×105pfu烟曲霉孢子。给予曲霉孢子后第二天收集肺组织及肺泡灌洗液。应用ELISA检测肺组织及肺泡灌洗液中肿瘤坏死因子(TNF)-α及GM-CSF水平;Real-time PCR检测肺组织Dectin-1 mRNA、IL-1β mRNA及IL-10 mRNA水平;HE染色及六胺银(GMS)染色分析肺组织炎症变化及肺部真菌水平;平板菌落计数评估各组真菌负荷;肺组织髓过氧化物酶(MP0)活力检测分析肺组织中性粒细胞水平;并进一步研究给予Ad-mDectin-1对烟曲霉感染小鼠生存率的影响。
　　结果：
　　ELISA检测发现各组肺组织及肺泡灌洗液中TNF-α水平无明显差异（肺组织中P=0.215，肺泡灌洗液中P=0.906），而Ad-mDectin-1组GM-CSF水平在肺组织和肺泡灌洗液中均较对照组升高，差异具有统计学意义（肺组织中: Ad-mDectin-1组vs PBS组，P＜0.001; Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P＜0.001。肺泡灌洗液中:Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.002; Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.003）。Real-time PCR检测各组肺组织中Dectin-1、IL-1β、IL-10水平。Ad-mDectin-1组肺组织Dectin-1mRNA水平高于对照组，差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.043;Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.031）。肺组织IL-1β mRNA水平在Ad-mDectin-1组(7.8087±1.6716)明显升高，约为对照组IL-1β mRNA水平(PBS组:2.6247±0.9735; Ad-EGFP组:3.0693±1.6587)的2.7倍，差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P＜0.001;Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P＜0.001）。肺组织IL-10mRNA水平，Ad-mDectin-1组与对照组无明显差异(P=0.997)。
　　HE染色提示Ad-mDectin-1组的小鼠肺组织表现出更明显的炎症反应，肺泡间隔增厚，炎性细胞渗出明显，并可观察到红细胞渗出，GMS染色显示Ad-mDectin-1组肺组织中的真菌数量也较对照组明显减少。相对于PBS组及Ad-EGFP组，Ad-mDectin-1组肺组织中孢子和菌丝的数量明显减少。通过肺组织平板菌落计数试验进一步验证了上述结论，Ad-mDectin-1组真菌负荷(5.7657±0.144)约为对照组(PBS组:6.0721±0.198; Ad-EGFP组:6.0721±0.227)的38.15％，差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.007; Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.007）。肺组织MPO检测提示，Ad-mDectin-1组小鼠肺组织MPO活力(0.3987±0.055)较PBS组(0.2964±0.026)及Ad-EGFP组(0.3011±0.033)明显升高，且差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.03;Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.036）。生存分析结果显示PBS组的生存率为50％，Ad-EGFP组的生存率为60％，Ad-mDectin-1组无小鼠死亡，生存率为100％。各组之间比较提示Dectin-1生存率相对于对照组差异具有统计学意义（Ad-mDectin-1组vs PBS组，P=0.012; Ad-mDectin-1组vs Ad-EGFP组，P=0.029; PBS组vs Ad-EGFP组，P=0.796)。
　　结论：
　　Ad-mDectin-1能够通过上调气道Dectin-1表达后提高烟曲霉感染小鼠肺组织IL-1β及GM-CSF水平，募集大量中性粒细胞向肺内感染病灶聚集，减轻肺内真菌负荷，提高烟曲霉感染生存率。

目录

摘要

前言

参考文献

第一章 Dectin-1重组腺病毒小鼠体外表达模型鉴定及安全性研究

1．1 材料

1．2 方法

1．3 结果

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

第二章 Dectin-1重组腺病毒对侵袭性肺曲霉病免疫保护作用

2．1 材料

2．2 方珐

2．3 结果

2．4 讨论

2．5 结论

参考文献

全文总结

英文缩略词

综述：腺病毒载体在呼吸系统疾病基因治疗中的应用

攻读硕士学位期间成果

致谢

声明