广东省1985～2013年非O1/O139群霍乱弧菌分子特征的研究

摘要

研究目的和意义：
　　1.比较分析广东省霍乱流行期和流行间歇期，不同来源的非O1/O139群霍乱菌株菌株分子特征。
　　2.在分子水平上了解不同流行态势下，非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的携带情况，并探讨其流行规律。
　　3.探讨不同PFGE克隆型与毒力基因携带情况的相关性，确定霍乱菌株的分子流行病学特征，为追踪菌株的来源和变迁，疫情态势评判提供科学、客观的依据。
　　研究方法：
　　1.运用流行病学基本理论，描述1985～2013年广东省不同来源的219株非O1/O139群霍乱弧菌菌株分布特征。
　　2.采用传统的生化鉴定和血清分型试验对菌株进行复核鉴定。
　　3.运用PCR的方法检测CTX基因元件（ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、rstR-18、rstR264、rstRclac、rstRclass、rstRElTor）、VPI毒力岛（tcpⅠ、tcpAEl Tor）、VSP-Ⅰ(O175、O178、O180、O183、O185)、VSP-Ⅱ(O490、O493、O498、O502、O504、O512、O514、O516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、SXT、ST、rtxA、IS1004、hlyA、mshA）。
　　4.采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型，并用BioNumerics软件进行聚类分析。
　　研究内容：
　　1.流行病学信息:将收集的219株非O1/O139群霍乱弧菌菌株基本信息运用流行病学基本理论进行描述性研究，分析不同年代、不同地区及不同来源的菌株分布情况，进一步比较广东省非O1/O139群霍乱菌株菌株的优势菌群和流行趋势及变化。
　　2.菌株的复苏培养鉴定及血清分型:将广东省疾病预防控制中心菌种库中非01/0139群霍乱弧菌冷冻干燥菌株进行复苏，纯培养后进行生化鉴定及血清分型。比较分析不同流行期间广东省非O1/O139群霍乱弧菌菌株血清型分布情况。
　　3.毒力基因检测:应用PCR方法对CTX基因元件（ctxB、rstR4、rstR6、rstR232、rstR-18、rstR264、rstR、rstRclac、rstRclass、rstRElTor）、VPI毒力岛(tcpⅠ、tcpAETor)、VSP-Ⅰ(O175、O178、O180、O183、O185)、VSP-Ⅱ(O490、O493、O498、O502、O504、O512、O514、O516)以及其它毒力基因(chxA、VCS(N2)、SXT、ST、rtxA、IS1004、hlyA、mshA）进行检测，计算阳性率及毒力基因型别，分析广东省非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因携带情况，为进一步研究非O1/O139群霍乱弧菌致病机理提供基础数据。并进一步比较分析广东省1985～2013年间，不同年代、不同地区、不同来源收集的非O1/O139群霍乱菌株携带的毒力基因情况，在分子水平上了解非O1/O139群霍乱弧菌毒力基因的分布特点和变迁，探讨其流行规律。
　　4.PFGE分子分型:采用脉冲场凝胶电泳(PFGE)方法对菌株进行分子分型，并运用Bionumerics6.6软件将PFGE带型比对分析，计算相似度，绘制PFGE聚类图谱。探讨不同PFGE克隆型与毒力基因的关联，追踪菌株的来源和变迁。
　　主要结果：
　　219株非O1/O139群霍乱弧菌主要分布在霍乱大流行期间，其中，1985～1989年分离到的非O1/O139群霍乱弧菌131株，为病人来源（110株）和外环境水体来源（21株），并主要分布在湛江（67株）、广州（20株）、汕头（16株）、海口（14株）（（1988年海南独立成省，之前都隶属于广东省）地区;1990～1999年，非O1/O139群霍乱弧菌菌株31株，病人（17株）、外环境水体（11株）以及水产品（3株）来源均有检出，且主要分布在阳江（13株）和广州（7株）地区;自2001后，非O1/O139群霍乱弧菌菌株数目已连续4年呈下降趋势，2007年出现小幅度回升，2012年又有一定的上升，各地区呈散在分布。
　　血清分型结果显示，219株非O1/O139群霍乱弧菌分属于VBO2，4，6，7，8,10,11,12,13,14,18,22,23,25,28,29,30,32,38,39,45,46,51，71，76，84，140，141和155共29个血清型，血清型较分散复杂，分型率达27.40％，远低于已发现的200个以上非O1/O139群霍乱弧菌血清型范围。
　　毒力基因分析结果显示，仅13株非O1/O139群霍乱弧菌菌株含有ctxB毒力基因，经进一步测序后发现均为EL Tor型，其中病人来源占76.92％(10/13)，外环境水体来源占23.08％(3/13)。其中，1985～1987年霍乱大流行期间监测到7株病人来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株，1996和1998年也监测到2株病人来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株，1999年监测到3株外环境水体来源的非O1/O139群霍乱弧菌产毒株，而2000年后的监测中已无非O1/O139群霍乱弧菌产毒株检出。33株非O1/O139群霍乱弧菌携带不同种类的rstR毒力基因，15株非O1/O139群霍乱弧菌tcpA阳性，同时检测到tcpⅠ也是阳性。CTX性噬菌体及TCP毒力基因分布情况为:ctxB+rstR+tcpA+tcpⅠ+(n=13)，ctxB-rstR+tcpA-tcpⅠ+(n=18)，ctxB-rstR+tcpA+tcpⅠ+(n=2)。病人来源的菌株中48.32％(72/149)携带不同种类的VSP岛毒力基因，其中，仅有3株携带完整的VSP毒力岛基因，其他菌株均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因;外环境水体来源的菌株中46.43％(26/56)携带不同种类的VSP毒力岛基因，其中，仅有1株携带完整的VSP毒力岛基因，其他菌株均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因;水产品来源的菌株中64.29％(9/14)携带不同种类的VSP毒力岛基因，没有携带完整的VSP毒力岛基因的菌株，均携带部分VSP-Ⅰ或者VSP-Ⅱ毒力岛基因。8个潜在毒力基因检测结果显示，病人来源菌株中35.57％(53/149)含有chxA毒力基因，62.42％(93/149)含有TTSS(vcsC2)基因，14.10％(21/149)含有SXT毒力基因，2.01％(3/149)含有ST毒力基因，95.97％(143/149)含有rtxA毒力基因，96.64％(144/149)含有mshA毒力基因，89.26％(133/149)含有ISI004毒力基因，93.29％(139/149)含有hlyA毒力基因。外环境水体来源菌株中55.36％(31/56)含有chxA毒力基因，33.93％(19/56)含有T7SS(vcsC2)毒力基因，14.29％(8/56)含有SXT毒力基因，1.79％(1/56)含有ST毒力基因，78.57％(44/56)含有rtxA毒力基因，87.5％(49/56)含有mshA毒力基因，64.29％(36/56)含有ISI004毒力基因，85.71％(48/56)含有hlyA毒力基因。水产品来源菌株中71.43％(10/14)含有chxA毒力基因，57.14％(8/14)含有TTSS(vcsC2)基因，7.14％(1/14)含有SXT毒力基因，7.14％(1/14)含有ST毒力基因，85.71％(12/14)含有rtxA毒力基因，92.86％(13/14)含有mshA毒力基因，85.71％(12/14)含有ISI004毒力基因，100％(14/14)含有hlyA毒力基因。
　　主要结论：
　　1.1985～1989年分离到的非O1/O139群霍乱弧菌较多，为病人来源和外环境水体来源，并主要分布在湛江、广州、汕头、海口;1990～1999年，非O1/O139群霍乱弧菌菌株数目明显减少，且主要分布在阳江和广州地区;自2001后，非O1/O139群霍乱弧菌菌株数目已连续4年呈下降趋势，2007年出现小幅度回升，2012年又有一定的上升，各地区呈散在分布。
　　2.血清型较为分散复杂，分型率达到27.40％，但远低于已发现的200多种非O1/O139群霍乱弧菌的血清型范围，因此应加快研发生产更加广泛的非O1/O139群霍乱弧菌分型诊断血清，及时发现新的血清型别，提高分型率。
　　3.毒力基因检测发现仅13株非O1/O139群霍乱弧菌菌株含有ctxB毒力基因，经进一步测序后发现均为EL Tor型。毒力基因特征多样，存在ctxB基因缺失，表现为TCP、VSP-Ⅰ/Ⅱ毒力岛基因元件部分阳性，具备此基因特征的菌株一般仅引起散发的腹泻病例，但仍应密切关注此类菌株数量的增加。
　　4.PFGE分型发现菌株间无明显的聚类，且不同年份以及不同地区病人来源的菌株也不形成明显的聚类，说明广东省省非O1/O139菌株之间存在着明显的遗传多样性。

目录

摘要

第一章 引言

1．1 霍乱弧菌的流行情况

1．1．1 霍乱弧菌的流行趋势

1．1．2 非O1／O139群霍乱弧菌流行情况

1．2 霍乱弧菌的流行特征

1．3 霍乱弧菌分型及表型特征

1．3．1 霍乱弧菌的血清分型

1．3．2 霍乱弧菌的噬菌体-生物分型

1．3．3 非O1／O139群霍乱弧菌抗原组成及特征

1．4 霍乱弧菌的分子生物学研究进展

1．4．1 霍乱弧菌的致病性研究进展

1．4．2 非O1／O139群霍乱弧菌的致病因子

1．4．3 霍乱弧菌的分子分型研究进展

1．5 实验研究思路

1．6 实验研究意义

第二章 材料与方法

2．1 菌株来源

2．2 实验仪器及试剂

2．2．1 实验仪器

2．2．2 实验试剂

2．3 实验方法

2．3．1 菌株的复苏

2．3．2 菌株的分离及生化鉴定

2．3．3 血清分型

2．3．4 毒力基因检测

2．3．5 PFGE分型

第三章 结果与分析

3．1 流行病学概况

3．2 血清分型结果

3．3 毒力基因检测结果

3．4 PFGE分型结果

第四章 讨论

4．1 霍乱弧菌流行情况及基因型变化趋势分析

4．1．1 广东省1985~2013年霍乱弧菌的流行分布

4．1．2 霍乱弧菌的毒力基因分布特点

4．2 PFGE分子分型技术在霍乱弧菌分子流行病学中的应用及结果

第五章 全文小结

参考文献

攻读硕士学位期间发表学术论文目录

致谢

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