eNOS解偶联与模拟潜艇逃生大鼠肺动脉内皮损伤的关系与血小板活化的干预研究

摘要

目的:
　　随着潜艇逃生技术的发展，各国海军模拟潜艇逃生技术在向更深的海域前进，而阻碍其前进的障碍之一就是减压病的气泡损伤。减压病的机理:人体每下潜10m，大致相当于增加一个大气的压力。机体在高压力的环境下，肺泡内的各种气体分压增高，并平衡于吸入压缩空气中各种气体的分压相。肺泡内的气体分压高于血液中的气体分压，因而相应地增加了气体在血液中的溶解量。当人体由高气压环境快速减压，体内压力超过外界总气压较多，于是溶解于血液或组织内的气体在几秒至几分钟内游离为气相，并以气泡形式聚积，阻塞于组织和血液中;大部分的O2及CO2可迅速被血浆内成分如:血红蛋白所吸收，仅少数以物理状态游离于体液中，而氮气是惰性气体不能被组织所吸收，可长期以气泡状态存在。气泡可聚集在血管内形成栓塞，阻碍血液循环。并可通过气泡与血管内皮细胞的直接接触引起血管内皮细胞功能障碍，内皮依赖的血管舒张能力降低，导致远端组织缺血、水肿及出血，排氮障碍。并有文献报道气泡可激活血小板，引起血小板活化聚集，即气泡介导的血小板活化bubble-induced platelet aggregation(BIPA)从而进一步阻塞血管，是形成减压病的重要机制。
　　益肺活血颗粒(Yifei Houxue granule，YFHXG)是董建华院士根据临床治疗经验拟定，主要用于治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)及肺动脉高压(PAH)，方剂中黄芪、党参可补益全身之气，川芎、桃仁、赤芍、红花等则有活血化瘀之功效。现代医学研究表明川穹根茎中可提取分离出一种生物碱单体:四甲基吡嗪，即川芎嗪，是临床效果公认的活血化瘀中药提取物。川芎嗪可抑制血小板聚集和降低血小板活性、增加冠状动脉和脑血管血流、降低血液粘度、改善微循环及血液流变性等，具有扩张血管的作用。考虑模拟潜艇逃生大鼠患减压病机制中存在BIPA，基于该制剂有活血作用，我们采用该方剂研究其对减压病是否存在干预作用。
　　国内外学者普遍认为，不安全减压可导致血管及组织内气泡形成。相关研究表明不论气泡直径是否大于血管管径、无论气泡数目多少，它的流向、流速及流态均取决于血管的功能状态。气泡作为一种流体，在血流、血压的作用下，可变形通过各种管径、各种走形的血管，继而随着血液循环。只有当血管功能障碍导致血管痉挛闭锁和血液停滞，才引起气泡无出路。当血压的作用力小于血管闭合时，气泡呈静止状态，导致减压病的发生。因此，我们推测减压病可影响血管舒张能力。血管舒张分为内皮依赖性血管舒张及非内皮依赖性血管舒张。内皮依赖性血管舒张可由乙酰胆碱、缓激肽等刺激引起，主要介导生理刺激下引起的血管舒张。NO是内皮依赖性血管舒张的重要因子。NO由一氧化氮合成酶(NOS)合成，NOS包括内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合成酶(iNOS)、神经型一氧化氮合成酶(nNOS)三型，nNOS为神经型，多位于神经元细胞;iNOS为诱导型，在炎症的病理状态下可诱导生成;eNOS在血管内皮细胞中稳定表达，可合成生理需要量NO，eNOS在二聚体形态下将左旋精氨酸转化为NO，NO是内皮依赖性血管舒张的重要因子。NO由一氧化氮合成酶(NOS)合成，eNOS在血管内皮细胞中稳定表达，可合成生理需要量NO，eNOS在二聚体形态下将左旋精氨酸转化为NO，当eNOS解离为单体时则不能正常合成NO，而生成大量超氧阴离子O2-，O2-和NO反应生成大量ONOO-，对血管组织中的蛋白进行了氮化修饰，改变信号途径，直接和间接介导NO的细胞毒性效应。目前研究中尚未探讨减压病中血管功能的损伤是否与eNOS解偶联相关，本研究对其进行初步探讨。
　　方法:
　　实验动物选用SD大鼠，随机分为5组，(1)空白对照组:将30只大鼠置于0.3m3的加压舱，用于小型动物复现DCS，不予加压处理，停留65min，持续通入空气，维持二氧化碳(CO2)水平低于300ppm，舱内湿度维持于40％-60％，温度维持27-30℃。大鼠在舱内可自由活动并通过环闭路电视显示、记录系统，观察大鼠舱内行为。(2)模型组(DCS):将30只大鼠置于与对照组相同的加压舱内设置相同的温度、湿度。以100kpa/min的速度加压舱内空气至600kpa(相当于60msw)维持60min，并持续通入空气，维持CO2水平低于300ppm，并以相同速度减至常压。(3)低剂量YFHXG组:DCS模型制作+YFHXG(0.165g/kg)，将30只大鼠按照剂量喂服益肺活血颗粒0.165g/kg，每日两次，连续喂服，1周后将30只大鼠按照DCS组方式进行疾病模型制造。(4)中剂量YFHXG组:DCS模型制作+YFHXG(0.33g/kg)，将30只大鼠按照剂量喂服益肺活血颗粒0.33g/kg，每日两次，连续喂服，1周后将30只大鼠按照DCS组方式进行疾病模型制造。(5)高剂量YFHXG组:DCS模型制作+YFHXG(0.66g/kg)，将30只大鼠按照剂量喂服益肺活血颗粒0.66g/kg，每日两次，连续喂服，1周后将30只大鼠按照DCS组方式进行疾病模型制造。
　　分别记录每组大鼠患减压病及死亡的数量，将每组存活大鼠行腹主动脉采血，采用流式细胞检测法检测每组大鼠血小板活化情况，放射免疫法检测血清中6-keto-PGF(lalpha)和TXB2水平，在麻醉下取存活大鼠肺组织，行肺免疫荧光染色，观察血小板肺内聚集情况，剥离肺动脉组织采用免疫荧光染色检测组织因子在肺动脉内的表达量。
　　将DCS组存活大鼠及对照组大鼠麻醉后剥离肺动脉，检测离体肺动脉内皮依赖的血管舒张力，采用western blot免疫印迹方法检测肺动脉组织中内皮型一氧化氮合成酶(eNOS)表达、解离情况以及肺动脉组织中各蛋白硝基化水平，行离体肺动脉超氧化物阴离子探针(DHE)染色检测活性氧ROS形成情况。
　　结果:
　　在血小板活化方面，空白组与DCS组及低、中、高剂量YFHXG组，DCS患病率及死亡率没有差异(P＞0.05)。流式细胞显示，与空白对照组比较，YFHXG组与DCS组血小板活化率明显升高(P＜0.05);而与DCS组比较，YFHXG组血小板活化率有所减低，并且呈药物浓度梯度减低(P＜0.05)。免疫荧光显示:与对照组比较，DCS组与YFHXG组中肺组织血小板聚集明显增加，并且益肺活血颗粒对DCS引起的血小板聚集有抑制作用。放射免疫提示:与空白对照组比较，YFHXG组与DCS组大鼠血清中TXB2水平明显升高，PGI2水平下降，TXB2/PGI2比值明显升高(P＜0.05);而与DCS组比较，YFHXG组TXB2/PGI2比值有所减低，并且呈药物浓度梯度减低(P＜0.05)。
　　在eNOS解偶联方面，DCS组存活大鼠肺动脉内皮依赖的血管舒张能力明显下降;eNOS表达量:DCS组及对照组无明显差异，但DCS组较对照组eNOS单体/二聚体比例明显升高;DCS组肺动脉组织各蛋白酪氨酸硝基化水平显著高于对照组;DHE染色见DCS组肺动脉中ROS生成量明显高于对照组。
　　结论:
　　通过上述实验研究及结论，发现模拟潜艇逃生过程中不安全减压致血管内气泡生成，导致减压病发生。使大鼠肺动脉出现内皮依赖血管舒张功能减弱，肺动脉中eNOS二聚体解离为单体，NO生成减少，ROS合成增加。同时DCS模型大鼠中出现大量血小板活化，TXB2/PGI2比值升高，肺组织中出现大量血小板聚集，但肺动脉中组织因子表达无变化。同时益肺活血颗粒可抑制DCS模型大鼠血小板活化及肺内聚集，并降低TXB2/PGI2比值。
　　通过本次研究我们得到以下结论:
　　(1)模拟潜艇逃生大鼠，可出现内皮依赖性血管舒张功能障碍，其发生机制与eNOS解偶联相关;
　　(2)eNOS解偶联可导致NO合成降低，血管舒张能力下降，同时可引起ROS合成增加，介导血管组织的超氧化损伤;
　　(3)模拟潜艇逃生大鼠可出现气泡介导的血小板活化，导致血小板活化率增高，出现血小板肺内聚集;
　　(4)益肺活血颗粒可抑制血小板活化过程，并呈浓度依赖性，考虑与其活血作用有关;
　　(5)益肺活血颗粒虽能减低不安全减压后血小板的活化程度，但不能降低减压病的患病率及死亡率。考虑减压病为全身多组织、多系统损伤，包括氮麻醉、气压伤等，益肺活血颗粒的保护作用在减压病中较局限，尚不能够影响总体发病率及死亡率。

目录

摘要

第一章 研究背景及意义

1．1 潜艇逃生过程对机体的影响

1．2 减压病的损伤机制

1．2．1 eNOS解偶联发生于减压病中可能性论证

1．2．2 血小板活化在减压病损伤中的作用机制

1．3 中药益肺活血颗粒

1．3．1 益肺活血爝啦组方

1．3．2 益肺活血颗粒主要作用及研究

1．4 立题意义

参考文献

第二章 实验技术路线

2．1 引言

2．2 实验技术路线

2．2．1 实验技术路线图

2．2．2 实验创新及突破点

2．2．3 eNOS解偶联检测指标选择

2．2．5 血小板活化检测指标选择

2．3 实验材料、溶液与设备

2．3．1 益肺活血复方浓缩的制取

2．4 实验动物及分组

2．5 实验方法

2．5．1 实验动物造模方法

2．5．2 实验动物药物灌服方式

2．5．3 实验动物样本采取

2．5．4 离体血管舒张力测定方法

2．5．5 肺动脉eNOS含量测定及其解偶联检测方法

2．5．6 肺动脉组织中蛋白硝基化检测方法

2．5．7 肺动脉组织中ROS水平检测方法

2．5．8 血小板活化率检测方法

2．5．9 肺组织中血小板聚集检测方法

2．5．10 血清中6-keto-PGF(1α)及TXB2含量检测方法

2．5．11 肺动脉组织中vWF检测方法

2．6 数据统计学处理方法

参考文献

第三章 实验结果

3．1 模拟潜艇逃生大鼠eNOS解偶联情况

3．1．1 模拟潜艇逃生大鼠离体血管内皮依赖的血管舒张功能检测

3．1．2 3-硝基酪氨酸在肺动脉组织中的表达

3．1．3 eNOS表达及解离检测

3．1．4 肺动脉ROS检测结果

3．2 模拟潜艇逃生大鼠血小板活化情况及益肺活血颗粒干预研究

3．2．1 模拟潜艇逃生大鼠减压病的患病率、死亡率及益肺活血颗粒干预结果

3．2．2 模拟潜艇逃生大鼠气泡介导的血小板活化及益肺活血复方制剂干预结果

3．2．3 模拟潜艇逃生大鼠气泡引起血小板肺内聚集及益肺活血颗粒的抑制作用

3．2．4 模拟潜艇逃生大鼠肺动脉组织中vWF表达情况

3．2．5 模拟潜艇逃生大鼠血清中6-Keto-PGF1 α(PGI2的稳定代谢物)和TXB2(TXA2的稳定代谢物)及益肺活血颗粒的干预作用

第四章 结论与展望

4．1 主要结论及意义

4．1．1 模拟潜艇逃生大鼠eNOS解偶联与肺动脉内皮功能损伤

4．1．2 模拟潜艇逃生大鼠血小板活化情况

4．1．3 益肺活血颗粒对模拟潜艇逃生大鼠的干预作用

4．1．4 结论意义

4．2 展望

参考文献

综述

附件

成果

致谢

声明