探讨高压氧对缺氧/复氧模型下大鼠骨髓间充质干细胞的影响及相关机制研究

摘要

目的:
　　脊髓损伤(spinal cord injury，SCI)是中枢神经系统严重创伤性疾病，其致残率及病死率均较高，所造成的部分或完全运动神经、感觉神经缺失给患者的生活造成巨大的影响。脊髓损伤的修复和治疗一直是世界研究的热点和难点。而干细胞的发现是人类发育生物学和疾病研究中的重大突破。干细胞是具有增殖和分化潜能的细胞，具有自我更新复制的能力，能够产生高度分化的功能细胞，是形成哺乳类动物的各组织器官的原始细胞，这种多能性使得干细胞具有巨大的生物医学工程学潜能。
　　骨髓间充质干细胞(BMSCs)具有高度的自我复制能力和多向分化潜能，在一定的诱导条件下可跨胚层分化为神经细胞，从而替代缺损的神经功能;能促髓鞘再生、神经营养因子分泌;调控炎症反应，减轻继发性损伤对原位神经元的毒害性。许多研究已经表明，骨髓间充质干细胞能够定向迁移到损伤组织中并定植（归巢），发挥其庞大的神经修复作用。然而，当移植外源性骨髓间充质干细胞后，缺血病灶中仅有2％存活，这与脊髓损伤引起的继发性损伤，包括谷氨酸盐毒性物质、超载氧自由基、炎症细胞、各种细胞因子等有关。如何提高骨髓间充质干细胞在病灶中的存活率成为目前新的研究靶点。
　　高压氧在神经系统缺血性疾病中的应用已得到广泛的认可。其主要机制包括:①神经细胞对氧有特殊的依赖性和敏感性，而高压氧能显著提高患者动脉血氧分压及组织氧储量，增加氧弥散距离，改善脊髓缺氧状态。②高压氧能提高红细胞变形能力，降低毛细血管通透性。③高压氧能扩张机体动脉，促进血流速度，减少血小板聚集，降低血液粘滞度，从而增加脊髓供血。④高压氧纠正酸中毒，改善脊髓损伤部位的微循环及血流灌注，维持神经细胞能量代谢，并恢复可逆性损伤的神经元功能。研究表明，高压氧能够调控凋亡家族中Bax、Bcl-2在脊髓损伤中的表达，维持线粒体细胞膜电位的稳定性，减少细胞色素C的释放，阻断其下游caspase-3的级联反应而发挥抗凋亡作用。除此之外，高压氧还能促进内源性神经干细胞的增殖，诱导其向神经元分化，这可能与Wnt/β-catenin通路有关。已有文献报道联合高压氧治疗的干细胞移植可明显改善神经缺损症状，但当中的机制仍未明了。
　　Wnt通路在胚胎的发育过程中对细胞的增殖、分化、死亡、迁移和极化均起到重要的作用。β-catenin是经典Wnt通路中的核心调控因子，其表达水平决定着通路的开放与否。本实验通过模拟体内缺血再灌注损伤环境，探讨高压氧对骨髓间充质干细胞的保护机制，为细胞治疗学应用于脊髓损伤中的发展提供实验依据。
　　方法:
　　1、大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)的收集、培养及流式细胞鉴定细胞表面标志:选取健康的3-4周雄性SD大鼠(Sprague Dawley rat)，采用全骨髓贴壁法种植于25cm2培养瓶中。待细胞传至P3后选取CD29、45、90抗体并使用流式细胞仪鉴定细胞。
　　2、分组:将P3-P5细胞随机分成四组:正常对照组、缺氧/复氧组、缺氧/复氧+高压氧组、缺氧/复氧+高压氧+YC-1组。缺氧/复氧处理组种板24h后倒去完全培养基，无菌PBS冲洗1遍，更换为不含血清的L-DMEM培养，置于95％N2、5％CO2、37℃培养箱中，培养9h后取出细胞，更换为5％完全培养基，复氧2h。正常对照组更换为完全培养基并置于常氧环境中培养。高压氧组于复氧2h后介入。
　　3、高压氧处理:将细胞置于高压氧舱中，以含98％O2的混合气体洗舱10min，关闭舱门，然后在15分钟内升压至0.25，维持60min，随之在15min之内将舱内压力恢复至正常气压，1次/12h，连续3次。稳压期间舱内平均氧浓度不得低于98％。高压氧处理同时将非高压氧组置于同等氧舱中90min。
　　4、Hoechst33258染色观察细胞凋亡:以3×104/ml的密度接种于6孔板，处理结束12h后弃上清，4％多聚甲醛固定20min，PBS洗涤5min×2遍，向孔内滴加入500ulHoechst33258避光染色10 min，PBS洗涤5min×3遍，荧光显微镜下观察拍照。
　　5、CCK-8检测细胞毒性及增殖:以3×104/ml将细胞种植于96孔板中，每组设复孔4个，分别处理后向复孔中加入10ul CCK-8溶液，充分混匀后放入37℃培养箱中孵育1-2h，用酶标仪450nm波长测定各组吸光度，去除最大值及最小值，取其平均值后，按公式计算各组存活率，以OD值作细胞增殖曲线图。同时设置空白对照组。
　　6、流式细胞仪检测细胞凋亡:以5×104/ml将细胞种植于60mm培养皿中，给予不同处理结束后吸取上清液至离心管，贴壁细胞用PBS洗涤，胰酶消化后将细胞转入相应离心管，1000r/min离心5min，收集细胞。PBS洗涤两次后加入500μlAnnexinⅤ结合液悬浮细胞，再加入5ul AnnexinⅤ-FITC染色液，再加入5ul PI染色液室温孵育15 min，上流式细胞仪检测，采用Cell Quest软件进行结果分析。
　　7、Hoechst33258/PI双染观察细胞凋亡形态学:以5×104/ml将细胞种植于60mm培养皿中，处理结束12h后吸取上清并收集细胞，PBS调整浓度至106个/ml，取100ul细胞悬液，加入已混匀的Hoechst33258/PI(300ul∶6ul)染料，常温下避光孵育20min，取10ul滴于载玻片，加上盖玻片，荧光显微镜下观察拍照。
　　8、Western blot检测蛋白表达水平:冰上裂解各实验组蛋白后，分别收集到1mlEP管中，离心(12000rpm，4℃，20 min)，用蛋白浓度检测试剂盒测定总蛋白浓度并调整至同一水平。依次经过电泳、转膜、一抗和二抗孵育、显影及成像。凝胶成像系统扫描并分析HIF-1α、β-catenin、LEF-1、Cl.aspase-3、Bcl-2蛋白表达变化。
　　结果:
　　1、细胞的生长、形态及鉴定:
　　培养的骨髓间充质干细胞为圆形，大小不等，呈悬浮状，其间混有大量造血干细胞。培养48 h换液后，显微镜下可见呈圆形的折光性强的胞体;随着时间延长，贴壁细胞不断增多，细胞呈长梭形、有细小的突起，部分形成细胞集落。原代培养的细胞在1周左右融合达到80％-90％时可进行传代，此时细胞呈旋涡状或放射状排列。传代后细胞增殖速度增加，细胞纯度较高。流式细胞仪检测显示CD29和CD90高表达，分别为96.23+2.02％和97.28±1.3％，不表达造血干细胞特异性标记CD45，其阳性率为1.68±0.73％，符合间充质干细胞表面标记物的一般表达情况。
　　2、Hoechst33258染色:
　　正常组中由于DNA的完整性，细胞核染色后呈均一深蓝色，而缺氧/复氧组细胞核由于凋亡引起DNA双链结构被破坏，染色质浓缩，Hoechst染色后呈亮蓝色;随着缺氧/复氧时间的延长，凋亡的细胞数目不断增加，亮蓝色细胞核数目也逐渐增多。
　　3、CCK-8:
　　与正常组相比，缺氧/复氧组细胞存活率明显降低，差异具有统计学意义;给予高压氧处理后，细胞存活率明显升高，差异具有统计学意义;高压氧处理前加入YC-1阻断剂阻断HIF-1α表达后，细胞存活率明显下降(P＜0.05);与正常对照组相比，高压氧处理组的骨髓间充质干细胞并无明显增殖(P＞0.05)。
　　4、流式细胞仪检测细胞凋亡比例:
　　与正常组相比，缺氧/复氧组随着缺氧时间的延长，细胞发生凋亡比例逐渐增多，选取缺氧9h，复氧2h作为造模标准;与缺氧/复氧组相比，给予高压氧处理3次后，细胞凋亡率明显降低(P＜0.05);高压氧处理前加入YC-1阻断剂阻断HIF-1α表达后，细胞凋亡率明显升高(P＜0.05)。
　　5、Hoechst33258/PI双染观观察细胞凋亡比例:
　　荧光显微镜下可见，与缺氧/复氧组相比，给予高压氧处理后，PI阳性细胞比例有所下降（P＜0.05）;高压氧处理前加入YC-1阻断剂阻断HIF-1α表达后，PI阳性细胞比例明显升高(P＜0.05)。
　　6、Western blot检测蛋白表达水平:
　　Western blot结果显示缺氧/复氧后HIF-1α表达与正常对照组相比无明显差异(P＞0.05);高压氧处理能够诱导HIF-1α表达，给予YC-1阻断剂后，HIF-1α表达明显降低P＜0.05）;和缺氧/复氧组相比，高压氧处理组β-catenin、LEF-1表达增高，核内β-catenin表达增高，该作用可被YC-1阻断剂所抵消，三组之间两两相比差异均有统计学意义(P＜0.05)，这说明高压氧可能通过HIF-1α调控Wnt通路开放，从而发挥抗凋亡能力。与正常组相比，缺氧/复氧组Cl.aspase-3表达明显增高，同时Bcl-2表达下降，给予高压氧处理后Cl.aspase-3表达降低，Bcl-2表达增高，差异均具有统计学意义。
　　结论:
　　高压氧对缺氧环境中骨髓间充质干细胞具有抗凋亡作用。其机制可能与上调HIF-1α，从而激活Wnt/β-catenin通路，促进β-catenin进入胞核并上调LEF-1基因表达有关;该保护作用可被HIF-1α特异性阻断剂YC-1所阻断;除此之外，高压氧还能够下调Cl.aspase-3，上调Bcl-2;重复使用高压氧并不能促进骨髓间充质干细胞的增殖。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 大鼠骨髓间充质干细胞的培养

2．3 大鼠骨髓间充质干细胞的缺氧／复氧模型

2．4 高压氧对缺氧／复氧骨髓间充质干细胞的作用

2．5 高压氧对缺氧／复氧模型下大鼠骨髓间充质干细胞的机制

2．6 统计学方法

第三章 结果

3．1 BMSCs的培养及鉴定

3．2 Hoechst33258单染荧光显微镜观察凋亡细胞核的形态变化

3．3 CCK-8比较不同各组骨髓间充质干细胞存活率

3．4 流式细胞仪检测细胞凋亡比例

3．5 Hoechst33258／PI双染观观察细胞凋亡比例

3．6 Western blot检测蛋白表达水平

3．7 CCK-8检测高压氧处理后细胞增殖曲线图

3．8 统计学分析

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读学位期间成果

致谢

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