前列腺癌来源的外泌体诱导去势抵抗性产生的作用及机制的研究

摘要

前列腺癌不仅是泌尿外科最常见的男性恶性肿瘤，也是引起男性肿瘤相关性死亡的第二大杀手。去势抵抗性前列腺癌是指经过初次持续雄激素剥夺治疗(ADT)后疾病依然进展的前列腺癌。
　　本次课题研究，我们首先探讨了肿瘤微环境在前列腺癌细胞出现激素抵抗的过程中发挥的作用，继而从激素非依赖前列腺癌细胞提取了外泌体并加入到激素依赖性前列腺癌细胞中，通过体外和体内实验观察外泌体对前列腺癌细胞发生激素抵抗的影响，最后使用基因芯片和高效液相色谱/质谱探讨其中的作用机制，为延缓前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌提供分子基础，并为进一步治疗干预提供新的方向。
　　目的:
　　1.探讨肿瘤微环境在前列腺癌进展为激素非敏感这个过程中所起的作用。
　　2.验证外泌体是否参与前列腺癌进展为去势抵抗性前列腺癌这个过程。
　　3.探讨外泌体在去势抵抗发生、发展的过程中的作用机制。
　　方法:
　　1.LNCAP细胞与PC-3细胞共培养可以促进LNCAP细胞出现激素抵抗
　　2.PC-3细胞可以通过分泌外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗
　　3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗的作用机制的探讨及验证
　　4.探讨PC-3外泌体内诱导激素抵抗出现的作用分子
　　通过高效液相色谱/质谱法比对PC-3和LNCAP外泌体差异蛋白并通过Gene Ontology(GO)分析，探讨PC-3外泌体所含的作用分子。
　　结果:
　　1.LNCAP细胞与PC-3细胞共培养可以促进LNCAP细胞出现激素抵抗
　　1)光镜结果可以观察到，与PC-3细胞共培养后，LNCAP细胞的形态发生明显改变，细胞移动能力变强呈外向迁移，形态呈细梭形，形态变长，胞质明显减少。
　　2)MTS的结果显示，在正常条件下，与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞的增殖能力与正常的LNCAP细胞相比未发生明显改变;而在去势条件下，与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞在第3天到第5天增殖能力明显比正常的LNCAP细胞高。
　　3)平板克隆的结果显示，无论是正常条件还是在去势条件下，与PC-3细胞共培养后的LNCAP细胞的克隆形成能力都比正常的LNCAP细胞要强。在去势条件下，两组之间的差异更明显。
　　4)荧光定量PCR的结果显示，与PC-3细胞共培养后，LNCAP细胞的AR基因及其下游的CDK1、CDK2和GRBE1的mRNA水平明显下降。另外，与PC-3细胞共培养后，LNCAP细胞对雄激素的敏感性下降。
　　5)Western Blot的结果显示，与PC-3细胞共培养后，LNCAP细胞的AR和 PSA的蛋白水平明显下降。
　　2.PC-3细胞可以通过分泌外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗
　　1)透射电镜结果可以观察到，PC-3细胞外泌体和LNCAP细胞外泌体均具有典型的外泌体的特征，直径在50～100nm。
　　2)Western Blot的结果显示，两种前列腺癌细胞株来源的外泌体均表达exosome表面特异性标记物TSG101，Alix和HSP70，而不表达GAPDH。
　　3)MTS的结果显示，加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的增殖能力无论是正常条件还是在去势条件下都比正常的LNCAP细胞明显要强。在去势条件下，两组之间的差异更明显。
　　4)平板克隆的结果显示，无论是正常条件还是在去势条件下，加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的克隆形成能力都比正常的LNCAP细胞要强。在去势条件下，两组之间的差异更明显。
　　5)细胞周期的结果显示，无论是正常条件还是在去势条件下，加入PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞周期的S期的比例都要都比正常的LNCAP细胞要高。
　　6)体内成瘤实验结果显示，在正常条件下，PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞的成瘤能力明显比正常的LNCAP细胞强。特别是在去势条件下，正常的LNCAP细胞不能成瘤，而PC-3外泌体处理后的LNCAP细胞仍然能部分成瘤。
　　7)荧光定量PCR的结果显示，PC-3外泌体处理后，LNCAP细胞的AR基因的mRNA水平明显下降。另外，PC-3外泌体处理后，LNCAP细胞对雄激素的敏感性下降。
　　8)Western Blot的结果显示，与PC-3细胞共培养后，LNCAP细胞的AR和PSA的蛋白水平明显下降。
　　3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗的作用机制的探讨及验证
　　1)表达谱芯片分析结果提示:经过PC-3外泌体处理的LNCAP细胞和对照的LNCAP细胞相比，差异表达超过1.5倍的基因有72个，其中67个上调，5个下调。
　　2)荧光定量PCR的结果显示，PC-3外泌体处理后，LNCAP细胞的HMOX1基因的mRNA水平明显上升。
　　3)Western Blot的结果显示，PC-3外泌体处理后，LNCAP细胞的HMOX1的蛋白水平明显上升。
　　4)免疫组织化学的结果显示，激素非依赖前列腺癌的染色强度明显要比激素依赖性前列腺升高。
　　5)Western Blot和qRT-PCR结果显示hemin和针对HMOX1的siRNA均分别能有效上调和下调HMOX1的表达。
　　6)MTS的结果显示，上调HMOX1表达后，在雄激素存在的状态下，其增殖能力与正常LNCAP细胞之间无统计学差异。但是在缺乏雄激素的状态，上调HMOX1的表达可以促进LNCAP细胞的增殖。而当HMOX1的表达下调后，在雄激素存在的状态下可发现LNCAP细胞的增殖能力明显受抑制。而在缺乏雄激素的状态下，实验组和对照组的LNCAP细胞几乎都不能发生增殖。
　　7)平板克隆的结果显示，与正常的LNCAP细胞相比，通过Hemin处理的LNCAP细胞的克隆形成能力与正常LNCAP细胞之间无统计学差异。但是缺乏雄激素的状态下，正常的LNCAP细胞几乎不能形成克隆，而上调HMOX1的LNCAP细胞依然可以形成克隆。而当LNCAP细胞的HMOX1的表达受抑制后，与正常的LNCAP细胞相比，克隆形成能力无明显变化。在缺乏雄激素的条件下，三组细胞均不能形成克隆。
　　4.探讨PC-3外泌体内诱导激素抵抗出现的作用分子
　　1)高效液相色谱/质谱结果分析提示，有2815个蛋白存在于PC-3外泌体中，有2810个蛋白存在于LNCAP外泌体中，有2810个蛋白在两组中均存在，有5个蛋白只存在于PC-3外泌体中。其中LNCAP外泌体与PC-3外泌体相比，蛋白质含量差异变化1.5倍以上的蛋白质有1342个，其中上调的有677个，下调的有665个。
　　结论:
　　1.PC-3细胞与LNCAP细胞进行共培养后，LNCAP细胞在去势条件下的增殖能力和克隆形成能力明显提高。
　　2.PC-3细胞外泌体作用于LNCAP细胞后，LNCAP细胞在去势条件下的增殖能力和克隆形成能力明显提高。
　　3.PC-3外泌体促进LNCAP细胞产生激素抵抗可能是部分通过上调LNCAP细胞的HMOX1的表达起作用的。

目录

摘要

前言

第一部分 LNCAP细胞与PC-3细胞共培养可以促进LNCAP细胞出现激素抵抗

1．材料

2．方法

3．研究结果

4．讨论

5．小结

第二部分 PC-3细胞可以通过分泌外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗

1．材料

2．方法

3．研究结果

4．讨论

5．小结

第三部分 PC-3外泌体促进LNCAP细胞出现激素抵抗的作用机制的探讨及验证

1．材料

2．方法

3．研究结果

4．讨论

5．小结

第四部分 探讨PC-3外泌体内诱导激素抵抗出现的作用分子

1．材料

2．方法

3．研究结果

4．讨论

参考文献

附录

攻读博士学位期间成果

致谢

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