新生儿非结合性高胆红素血症遗传因素研究

摘要

新生儿高胆红素血症及其导致的黄疸是新生儿期常见的临床症状，50％～60％新生儿在出生一周内会经历不同程度的黄疸，早产儿中发生率更高。大部分黄疸可以自然消退，也有一部分新生儿发展为严重高胆红素血症，引起胆红素脑病和核黄疸，从而留下听力丧失、脑性瘫痪、智力发育障碍等后遗症。在当今具有光疗、换血等有效治疗手段的情况下，严重黄疸的发生率也有1％。因此对于新生儿高胆红素血症及其高危因素的早期识别、早期干预就显得尤为重要。
　　新生儿黄疸的主要特点是胆红素生成速率与胆红素转化及排泄的速率失衡，引起体内的胆红素负荷过重，导致黄疸的发生。人体的胆红素主要来源于衰老的红细胞。红细胞被单核吞噬细胞吞噬，释放出血红蛋白，血红蛋白被分解成血红素和球蛋白，血红素在血红素加氧酶(Hemeoxygenases，HO)的作用下，将血红素叶琳环氧化断裂，释放出CO和铁离子，并形成胆绿素，胆绿素被胆绿素还原酶(Biliverdin reductase isozymes，BVR)还原生成胆红素。胆红素从内质网中释放到血循环系统，称为游离（free）胆红素，也称为非结合胆红素(Unconjugated bilirubin，UCB)。游离胆红素不溶于水，与血清白蛋白连接，运载至肝脏。然后由肝细胞膜上的特有的一些转运蛋白从血液系统转运至肝细胞内。在肝细胞内的滑面内质网上的尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基转移酶1A1(UGT1A1)的催化作用下与葡萄糖醛酸结合形成水溶性、不能透过半透膜的结合胆红素(Conjugated bilirubin，CB)，继而随胆汁排泄至肠管。目前研究提示，位于肝细胞窦状隙膜的有机阴离子转运多肽(organic anion transport proteins，OATPs)参与肝脏对胆红素的摄取.有机阴离子转运多肽属于OATP超家族，也称为可溶性阴离子转运体(solute carrier organic anion transporter，SLCO)超家族。SLCO超家族含有11个成员，分为6个家族。胆红素是OAT1P1及OAT1 P3的配体。SLCO1B1，SCO1B3是其编码基因。
　　胆红素的代谢及其调节过程复杂，有多种酶、转运体及调控因子的参与，其中任一环节发生障碍都可能导致胆红素负荷增加，增加新生儿高胆红素血症，新生儿黄疸的风险。加之刚出生的新生儿由于本身生理代谢的特点，需要适应较大的胆红素负荷，任何代谢能力的异常，都可能出现比较明显的症状。病理性黄疸尤其是严重黄疸，常常是多种病因共同存在，影响着黄疸的发生和发展。环境和遗传的因素都可能对胆红素水平造成影响，继而与高胆红素血症的发生相关。近年来遗传因素在新生儿黄疸中的作用逐渐被人们认识。而在黄疸病因的探寻中，遗传因素又不易被发现或检测。
　　本研究中，我们以广东潮州地区出生的新生儿为研究对象，调查了胆红素生成及代谢相关的6个基因G6PD，UGT1A1，HO-1，SLCO1B1，SLCO1B3，BLVRA的多态在当地新生儿中的分布情况，并分析这些多态与临床上不明原因新生儿高非结合性胆红素血症发病风险的关系。探讨新生儿高胆红素血症的分子病理机制。同时我们采用用高分辨熔解曲线技术，建立一种可对这些基因中国人常见的多态位点进行快速分子筛查的方法。
　　本次研究的对象有两个来源，第一部分的新生儿为2010年10月～2012年5月期间在潮州中心医院接受新生儿筛查检测的新生儿。第二部分的新生儿来自2011年12月～2014年12月期间在潮州中心医院住院的足月新生儿（孕周≥37周，出生体重≥2500g），有严重疾病及重大出生缺陷的新生儿不纳入此次研究。根据其记录的最高TSB水平，参照黄疸的划分标准，分为黄疸组和非黄疸组。有明确黄疸原因的如ABO溶血，败血症，缺血缺氧性脑病的黄疸儿也不纳入此研究。
　　2010年5月至2012年12月，共有2500名新生儿(男:1365，女:1135)在潮州中心医院进行G6PD酶活性荧光法初筛，67名新生儿初筛阳性。 G6PD缺乏初筛阳性率为2.68％(67/2500)，男性阳性率为3.22％，女性为2.03％。与广东其它地区比较，潮州地区G6PD发生率低于毗邻的其他地区。但根据世界卫生组织的推荐标准，建议在男性G6PD缺乏率大于3％～5％的地区开展新生儿G6PD筛查。因此，在该地区进行新生儿G6PD筛查项目还是很有必要的。在这67名怀疑携带有G6PD基因突变的新生儿样本中，58名检出G6PD基因突变。用高分辨熔解曲线技术共筛查出7种G6PD突变类型(c.95A＞G，c.392G＞T,c.493A＞G，c.871G＞A，c.1360C＞T，c.1376G＞T和c.1388G＞A)并与测序结果吻合。
　　然后，我们挑选了胆红素代谢途径的5个重要基因的11个SNP，这些SNP位点多位于基因的启动子区或者基因编码区，进行病例-对照研究。9个单核苷酸多态的基因分型的方法采用的是我们建立的高分辨熔解曲线的方法，并随机挑选部分样本进行直接测序验证。候选SNP,连同其它可能的危险因素（年龄、性别，孕周）进行与新生儿高胆红素血症发生风险的相关性评估。经分析我们发现UGT1A1基因上的3个SNP位点rs4148323，rs6742078和(TA)n的低频等位基因、基因型及单倍体的频率在病例组和对照组新生儿中的分布不同，差异有统计学意义（P＜0.05）。校正年龄，性别，母乳喂养等与黄疸有关的危险因素后，rs4148323，rs6742078和(TA)n位点多态仍显示与高胆红素血症显著相关(P＜0.01)。携带rs4148323低频等位基因的杂合子及纯合子新生儿，也称为UGT1A1*6(211G＞A)的携带者，其发生高胆红素血症的风险逐渐升高，而rs6742078及(TA)n低频等位基因携带人群其发生高胆红素血症的风险反而降低(ORadj=0.16;p=0.0001 for rs6742807; ORadj=0.25;p=0.000 for(TA)n)。其中UGT1A1*6纯合子携带者比野生基因型人群其风险增高了12倍(ORadj=13.02;p=1e-04)，UGT1A1*6杂合子的携带人群其黄疸风险增加了1.67倍(ORadj=2.69;p=1e-04)。同样的，与最常见的单倍型GTA(TA)6相比，ATA(TA)6携带人群其发生高胆红素血症的风险增高，而单倍型GAT(TA)7的携带人群其发生高胆红素血症的风险反而降低。在剩余的四个胆红素代谢基因中，编码阴离子转运多肽的SLCOs家族中两个SNP位点-rs2306283及rs2117032也显示与增高新生儿高胆风险相关。同时我们还发现UGT1A1基因突变与母乳喂养对增高新生儿高胆风险存在叠加效应。母乳喂养同时携带有UGT1A1*6杂合或纯合突变的新生儿发生高胆红素血症的风险最高(OR=5.33;95％CI:1.77-16.10)，要显著高于仅存在母乳喂养或者携带UGT1A1*6突变但是人工喂养的新生儿人群(P=0.018)。
　　鉴于UGT1A1在胆红素代谢中的关键作用，和我们前面的研究。我们选择对血清总胆红素水平超过342μmol/L的严重高胆儿进行包括UGT1A1启动子TATA盒及所有外显子基因序列，及与溶血相关的G6PD基因及地贫基因突变的检测。
　　在调查的58名严重黄疸的新生儿中有7名诊断G6PD酶缺乏，4名检出携带地贫突变基因，44名检出至少携带一种UGT1A1基因功能区的杂合突变，其中9名为UGT1A1纯合突变。除了最常见的UGT1A1基因第一外显子c.211G＞A(Gly71Arg)突变，在严重高胆儿中还发现另外三种UGT1A1外显子突变类型-c.1091 C＞T(Pro364Leu),c.1352C＞T(pro451leu)，以及c.1456T＞G(Tyr486Asp)。我们还发现严重高胆儿同时携带有两个或两个以上基因突变的也不少。50％G6PD缺乏的高胆儿同时携带有UGT1A1突变，所有四名携带有地贫突变基因的高胆儿同时合并有G6PD缺乏或者UGT1A1基因突变。病例组-对照组比较，G6PD，UGT1A1基因突变频率病例组新生儿显著高于对照组新生儿。多元logistic回归分析，校正年龄，性别，母乳喂养等与黄疸有关的危险因素后，G6PD缺乏的新生儿其发生严重黄疸的风险是G6PD正常新生儿的12.87倍(95％CI:1.32～135.87);携带有UGT1A1基因211位杂合突变(G/A)、纯合突变(A/A)的新生儿相对于该位点为野生基因型(G/G)的新生儿其发生严重黄疸的风险分别提高了2.47倍(OR值为3.47，95％CI:1.26～9.55)和11.46倍(OR值为12.46，95％CI:1.09～142.7)。
　　我们的研究显示，胆红素代谢相关基因的多个位点的多态性都与不明原因的新生儿高胆红素血症相关，反映了病理性黄疸病因的复杂性。多个基因，基因与基因，基因与环境因素的相互作用影响的高胆的发生和发展。亚裔人群是黄疸的高发人群，在新生儿中除了开展G6PD筛查项目外，UGT1A1基因检测，特别是UGT1A1*6的筛查，可作为临床医生对新生儿黄疸风险的评估、病因探查及遗传咨询的一项辅助检查。
　　本研究应用HRM技术建立了一种可以对胆红素代谢相关基因中国人常见的多个SNP进行快速的基因分型的方法，可用于遗传性高胆红素血症的基因诊断还可用于其他胆红素相关疾病大规模的分子流行病学调查。

目录

摘要

前言

第一部分 广东潮州地区新生儿G6PD基因突变的高分辨熔解曲线分析

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

3．讨论

第二部分 胆红素代谢相关基因多态性与新生儿高胆红素血症相关性研究

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．1 一般临床资料

2．2 人群中各个待分析SNPs等位基因频率和基因型分布及各基因单倍体频率

2．3 各个SNPs位点与新生儿高胆红素血症相关性研究

3．讨论

4．小结

第三部分 UGT1A1基因分型在临床诊断新生儿高胆红素血症中的应用

1．材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

2．结果

2．1 一般临床资料

2．2 严重黄疸儿G6PD基因，UGT1A1基因，地贫基因突变携带率及与对照组比较

2．3 G6PD缺乏与UGT1A1突变与严重黄疸相关性分析

2．4 迁延性黄疸与UGT1A1基因c．211 G＞A相关性分析

3．讨论

全文总结

参考文献

缩略词表

攻读博士期间论文发表情况

致谢

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