柴胡皂苷d通过EGFR/p38信号通路诱导肾癌细胞周期阻滞和细胞凋亡

摘要

肾癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤之一，在过去十年里其发病率一直在增加。众所周知，晚期肾癌患者对放化疗不敏感，但是为了提高患者生存质量，及时的处理骨转移、肿瘤局部复发、远处淋巴结转移，姑息性放疗可以达到缓解疼痛的效果。近年来，临床开展了立体定向放射治疗（γ刀、x线刀、三维适形放疗等)对复发病灶进行治疗。细胞因子被认为在晚期肾癌患者中有疗效，尤其是干扰素-α和白介素2。干扰素-α主要抗肿瘤机制:抑制肿瘤细胞癌基因表达和DNA合成;直接抑制肿瘤细胞增殖;诱导终端分化的肿瘤细胞，促进分化抗原表达;激活淋巴因子，增强NK细胞介导的ADCC活性和T细胞、粒细胞、单核细胞的细胞毒性;抑制肿瘤血管生成生长因子受体数量和减少肿瘤细胞增殖和扩散。分子生物学的发展使得肾癌细胞信号通路成为晚期肾癌治疗的关键靶点，这些分子靶点在晚期肾癌的治疗、分子靶向治疗向治疗中发挥着重要作用。临床常见的分子靶向药物有:抗血管生成药物，调节细胞生长和血管生成信号蛋白(mTOR)抑制剂。美国食品和药物管理局(FDA)批准用于治疗转移性肾细胞癌(mRCC)分子靶向药物有6种:舒尼替尼、帕唑帕尼、索拉非尼、贝伐单抗、西罗莫司、依维莫司。但是靶向药物的疗效也很有限，而且价格昂贵，所以需要找的一种经济有效的抗肾癌药物。
　　中医是祖国的传统医学，在很多基本疾病的治疗中发挥了很重要的作用，根据史料记载，早在宋朝，有开始有人开始应用中医来治疗肿瘤，并且获得了较好的疗效，但是其中的相关机制仍不是很明确。近年来，随着中西医学的发展，中西医在肿瘤中的治疗进展迅速，可能治疗机制包括:减轻肿瘤患者的疼痛，改善肿瘤患者的临床症状，提供肿瘤患者的免疫能力，并且可作为肿瘤患者术后辅助治疗的可选方式之一，而且现在很多肿瘤医师也会联合化疗和中药来治疗肿瘤晚期患者，并且可提高肿瘤患者生存质量，延长肿瘤患者的中位生存期。
　　目前已经运用在临床上的抗肿瘤作用的中药也较多，并且很多学者开始研究中药在肿瘤中发挥作用的分子机制。研究表明，红花组织可通过减低胃腺癌BGC-823细胞VEGF及碱性成纤维生长因子的表达作用，从而降低BGC-823细胞中MMP-9对细胞外基质的降解作用。蜈蚣提取液可抑制肿瘤肝癌血管的生成，该作用机制可能和该中药可降低肿瘤细胞中促血管生成素2及VEGF的表达相关。陈皮提取物可通过减少S180细胞的细胞周期相关因子，促进肿瘤细胞的凋亡，从而抑制肿瘤细胞的生长。温郁金提取物可通过抑制胃癌细胞SGC-7091分泌IGF-1从而抑制胃癌细胞的生长。由此可见，中药对肿瘤的作用日渐明确，而且其抗肿瘤的机制也在被发掘中。
　　目前，随着度中草药研究的日益深入，已经有很多中药在泌尿系肿瘤中的治疗作用越来越重要。研究表明，紫杉醇可抑制人膀胱癌细胞的生长，丝裂霉素可抑制小鼠睾丸肿瘤细胞的生长。北豆根提取物对膀胱癌细胞T-24及肾癌细胞786-O有抑制作用，其抗肿瘤机制可能和促进肿瘤细胞早期凋亡，抑制肿瘤细胞生长相关信号通路相关。
　　柴胡皂甙(Saikosaponin，SS)是中药柴胡的主要活性成分，共分a，b，c，d等9种，其中柴胡皂甙d(SSd)药理活性最强，早前的研究显示SSd具有(1)解热、镇痛和抗炎作用的药理活性，和常用的非甾体消炎药相似，并可能也是通过抑制COX的活性，影响花生四烯酸的代谢而发挥作用的;(2) SSd显示出多种肿瘤的抑制作用，并可调节免疫系统功能和细胞生长。上世纪80年代末日本学者小管卓夫最早研究报道了SSd的抗肿瘤作用，其后柴胡及SSd的抗癌、抑癌作用日益受到国内外学者的关注，包括对肝癌，甲状腺癌，宫颈癌，肺癌等肿瘤的抑制作用，目前SSd在泌尿系肿瘤中治疗的报道较少，MINYAO等在一项前列腺癌细胞DU145的研究中发现，SSd可以通过抑制DU145细胞的凋亡抑制肿瘤细胞的生长，并且可将DU145的细胞周期阻滞在G0/G1期，但是现在并没有研究报道SSd在肾癌中的治疗作用。
　　目的:
　　本研究拟探讨，SSd对肾癌细胞769-P及786-O的生长抑制作用，从而揭示SSd对肾癌治疗作用的相关机制。
　　方法:
　　1、采用MTT实验检测细胞活性:在96孔板中加入含有1000个细胞的50μl培养基，然后用不同浓度的SSd处理不同的时间后，去除培养基，加入适量0.5mg/ml的MTT，37℃孵化1h，最后去除MTT液体，加DMSO溶解沉淀。酶标仪检测490nm吸光度，实验重复三次。
　　2、细胞克隆体形成实验:肾癌细胞（769-P和786-O）按100细胞/每孔接种到24孔板中，不同浓度SSd（10μM、20μM、30μM）处理后，连续培养14天后，去除培养基，PBS清洗细胞，70％的冰醋酸固定细胞，结晶紫染色并显微镜下计算细胞克隆体数目。
　　3、细胞周期的检测:细胞达到60-80％融合率后，不同浓度SSd（0和10μM）处理细胞48h后，胰蛋白酶消化细胞后，取细胞悬浮液，PBS洗细胞两遍，70％的乙醇在4℃固定细胞1h，在用PBS洗细胞，PI染色，在室温暗室中孵化30分钟。最后，流式细胞仪检测细胞DNA含量。
　　4、细胞凋亡的检测:肾癌细胞(769-P和786-O)在不同浓度SSd(0、10和20μM)处理48h。胰蛋白酶消化细胞，收集悬浮细胞，AnnexinⅤ和PI双染细胞，最后流式细胞仪检测细胞染色情况。
　　5、western blot实验检测SSd对肾细胞(769-P和786-O)相关蛋白表达的情况:细胞中加入含蛋白酶抑制剂的细胞裂解液RIPA(50mM Tris-HCl/pH7.4、1％NP-40、150mMNaCl、1mMEDTA、1mMPMSF、1mMNa3VO4、1mMNaF、1mMokadaic acid和1mg/ml aprotinin、leupeptin、和pepstatin）。聚丙酰胺凝胶电泳采用10-15％SDS-PAGE，每孔加入20μg蛋白，转膜采用PVDF膜。封闭采用5％BSA，室温1h，一抗孵化4℃过夜。洗膜后，抗兔、抗鼠或抗羊二抗室温孵化1h。ECL发光法检测实验结果。
　　6、所有统计分析采用SPSS22.0进行，定量数据表示为X±SE和各处理组之间的差异是由单向ANOVA分析，随后进行Dunnett的t检验单独的比较。当比较只涉及2组，使用t检验。 P＜0.05被认为表明统计学显著差异。
　　结果:
　　1、MTT实验结果提示SSd处理后肾癌细胞活性呈下降趋势，这种下降趋势呈现出浓度梯度及时间梯度，不同浓度的SSd(0、10、15、20μM)处理肾癌细胞（769-P和786-O）48小时后，在769-P细胞和786-O细胞，细胞存活率分别是100％、66.7％、35％、11％和100％、68％、34％、19％。而如果固定SSd浓度为15μM后，分别处理0、24、48、72小时后，在769-P细胞和786-O细胞中，细胞存活率分别是100％、52％、30％、10％和99％、57％、29％、10％。且各组和对照组相比较都有统计学差异。这表示SSd对肾癌细胞有杀伤作用，且浓度越高肾癌细胞有杀伤作用越强，SSd药物处理时间越长，药效越好。
　　2、平板克隆实验提示在769-P细胞和786-O细胞中不同浓度SSd(0、10、20、30μ M)处理14天后，形成的克隆数分别是146、50、19、2和106、42、7、1，且实验组和对照组相比都有统计学差异。
　　3、细胞周期实验提示没有加SSd处理的769-P细胞和786-O细胞，细胞周期分布:G1期48％，S期42％，G2期10％和G1期41％，S期54％，G2期4％。20μM的SSd处理肾癌细胞24-48h后，在769-P细胞和786-O细胞，细胞周期分布:G1期72％，S期24％，G2期4％和G1期72％，S期21％，G2期7％。从中我们可以得出SSd可以阻滞肾癌细胞的细胞周期，并且将细胞周期阻滞在G0/G1期。
　　4、细胞凋亡实验提示SSd处理后的细胞AnnexinⅤ阳性的细胞与对照组相比，呈明显增加趋势，并有显著差异，在769-P的细胞中，AnnexinⅤ阳性的细胞率分别是9.6％和16.6％，在786-O细胞中AnnexinⅤ阳性的细胞率分别是21.2％和49.8％。我们使用western blotting实验检测凋亡相关基因的表达，我们发现SSd处理后的细胞p53表达量呈上升趋势。
　　5、SSd通过EGFR/p38 MARK信号通路抑制肾癌细胞（769-P和786-O）的生长。磷酸化的EGFR，磷酸化的MEK，磷酸化p38和其下游的c-Fos蛋白，SSd处理后蛋白表达量明显减少。然后分别用EGFR抑制剂AG1478和p38抑制剂SB203580处理细胞后发现，p-EGFR和p-p38的表达量明显降低，并且降低程度和SSd处理的效果相似。
　　结论:
　　本课题研究了SSd对肾癌细胞(769-P和786-O)的生长抑制作用，发现SSd可以阻滞肾癌细胞（769-P和786-O）于G0/G1期，诱导细胞凋亡，并且和p53的上调相关。进一步的研究表明SSd可能是通过EGFR/p38信号通过抑制肾癌细胞的生长。我们的研究不但解释了SSd抑制肾癌细胞生长的可能机制，还为肾癌临床药物治疗提供了一种新方法和新思路。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料

1 主要仪器

2 实验主要试剂及耗材

3 主要试剂的配置

第三章 方法

1 肾癌细胞的培养

2 SSd对肾细胞(769-P和786-O)生长的抑制实验

3 平板克隆实验检测SSd对肾细胞(769-P和786-O)的生长抑制实验

4 细胞周期实验检测SSd对肾细胞(769-P和786-O)生长周期的阻滞作用

5 流式细胞仪检测SSd对肾细胞(769-P和786-O)细胞凋亡的促进作用

6 western blot实验检测SSd对肾细胞(769-P和786-O)相关蛋白表达的情况

7 利用EGF刺激肾癌细胞(769-P)后，分别加EGFR抑制剂AG1478、p38抑制剂SB203580或SSd处理细胞后，检测769-P细胞中p-EGFR及p-p38蛋白表达量的变化

8 统计学分析

第四章 结果

1 MTT实验结果提示SSd对肾癌细胞(769-P和786-O)的生长抑制作用

2 平板克隆形成实验研究SSd对肾癌(769-P和786-O)的生长抑制作用

3 流式细胞仪检测SSd处理后的细胞周期变化

4 流式细胞仪检测细胞凋亡的变化，western blotting检测细胞凋亡相关蛋白的变化

5 western blotting 检测肾癌细胞中相关蛋白的变化

第五章 讨论

第六章 小结

本研究的不足之处和下一步研究计划

参考文献

综述：肾癌诊疗研究进展

英文缩略词表

硕士期间发表的论文

致谢

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