生物型异种骨生物相容性细胞学及免疫学研究

摘要

目的:本实验分细胞学实验及免疫学实验两部分，细胞学实验采用材料在体外与细胞共培养，通过Transwell试验测定成骨细胞的迁移能力，流式细胞仪检测成骨细胞的细胞周期和细胞凋亡情况，ANPP法检测AFP，MTT法评价异种骨的细胞毒性，溶血试验观察材料与血液的相容性情况。结合上述方法来综合评价异种骨与成骨细胞的体外的成骨能力和生物相容性。免疫学实验通过建立羊颈椎异种骨融合器植入动物模型，观察异种骨植入后分时段抽取动物模型血液，通过流式细胞仪来检测不同时间点CD4+及CD8+淋巴细胞，CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞的含量来评定免疫排斥反应情况，进一步为生物型异种骨移植材料应用于临床提供安全性和有效性的依据。
　　方法:生物型异种松质骨:由广东冠昊生物科技股份有限公司采用已获得美国专利授权(US6106555A，US6231614B1)的技术制备;生物型异种骨颈椎融合器:由广东冠昊生物科技股份有限公司制备;SD大鼠成骨细胞株由广州军区总医院骨科实验室液氮冻存;成年本地山羊18只，体重25～30kg，由广东冠昊生物科技有限公司动物实验中心提供。
　　第一章 异种骨生物相容性细胞学研究
　　方法:
　　实验分成3组，分别是实验组（交联的异种骨组），阳性对照组（未交联的异种骨组）和阴性对照组。实验组将交联的异种骨与SD大鼠成骨细胞在H-DMEM培养基中进行共培养;阳性对照组将未交联的异种骨与SD大鼠成骨细胞在H-DMEM培养基中进行共培养;阴性对照组将SD大鼠成骨细胞直接在普通H-DMEM培养基中单独培养。分别于培养后1、3、5、7天用四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyltetrazolium，MTT)法测定吸光度值，以评价细胞的增殖情况，反应异种骨的细胞毒性及生物相容性。采用PNPP偶氮法分别测定3天，1周，2周，3周时的ALP量，以评价异种骨对成骨细胞成骨的影响。应用流式细胞仪检测细胞周期变化以及成骨细胞凋亡情况，以评价异种骨对成骨细胞细胞周期和凋亡的影响。
　　结果:
　　1、成骨细胞增殖活性培养1、3、5、7d后在显微镜下观察可见实验组，阳性对照组及阴性对照组成骨细胞形态均良好。实验组与对照组相比，随着培养时间延长，OD值均升高，在1d、3d、5d、7d时间点，三组间比较采用方差分析和LSD-t检验，数据统计学分析显示同一时间点三个组间吸光度值两两比较差别均无显著统计学差异(P＞0.05)，MTT法测定OD值可间接反应细胞增殖数量，表明异种骨材料对成骨细胞增殖活性无不良影响，与成骨细胞相容性良好，无明显细胞毒性。
　　2、PNPP偶氮法测定出ALP的OD值加入成骨诱导液后3天后在显微镜下观察三个组的成骨细胞形态，结果显示三个组H-DMEM培养基中生长的成骨细胞形态均良好，采用PNPP法测定OD值可间接反应细胞成骨能力，本实验结果显示随着培养时间延长，三个组OD值均升高，表明三组细胞生长状态良好。三组间比较采用方差分析和LSD-t检验，统计学分析结果显示3天及7天时3组间两两比较均无显著统计学差异(P＞0.05);2周及3周时，实验组及阳性对照组跟阴性对照组比较差别均有显著统计学差异(P＜0.05)，实验组跟阳性对照组比较差别有显著统计学差异(P＜0.05)。
　　结论:
　　1、生物型异种骨体外培养状态下可以促进大鼠成骨细胞的成骨能力和迁徙能力，交联后的异种骨比未经交联处理的异种骨这种促进作用更加明显。
　　2、生物型异种骨体外培养状态下24小时内对大鼠成骨细胞的凋亡无明显影响，48小时时，未交联的异种骨可以明显增加成骨细胞的凋亡率，而交联后的异种骨无此影响。
　　3、生物型异种骨体外培养状态下对大鼠成骨细胞成骨的增殖活性和细胞周期无不良影响，不会引起明显溶血反应，具有良好的生物相容性。
　　第二章 异种骨生物相容性免疫学研究
　　方法:
　　18只成年本地山羊，体重25～30kg，随机分成3组，每组6只。A组为自体髂骨组，手术植入自体髂骨，钢板固定;B组为异种骨融合器组，手术植入异种骨融合器加自体骨，钢板固定;C组为阴性对照组，不给予手术处理，用于对照。分别于1w、2w、4w、8w抽取实验动物血液20ml，应用流式细胞仪分别测定各个时间点各组血标本中CD4+/IL-2+，CD4+/IL-4+; CD4+，CD8+T淋巴细胞的含量，用于评价山羊对异种骨免的疫排斥反应情况。
　　实验数据采用SPSS20.0统计软件进行分析，以均数±标准差((x)+s)表示，实验数据采用方差分析和LSD-t检验，P＜0.05为有显著统计学差异。
　　结果:
　　1、一般情况1只山羊术后当天因麻醉相关并发症死亡，当天补上1只替代。所有山羊术后正常进食及野外放养，每天观察伤口情况，术后部分山羊切口轻度肿胀，5天后肿胀基本消失。术后所有伤口愈合良好。
　　2、标本大体观察术后12周时A组颈3/4椎体间大部分融合，融合节段可见大量骨痂形成;B组融合器与上下椎体融合较差，结合处可见少量骨痂。术后24周时A组两椎体完全融合，B组融合效果欠佳。
　　3、CD4+及CD8+T细胞测定结果1周时，三个组间两两比较均无显著统计学差异（P＞0.05）;2周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞数值比较均无显著统计学差异(P＞0.05);自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均有显著统计学差异(P＜0.05);异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均有显著统计学差异(P＜0.05);4周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均无显著统计学差异（P＞0.05）;自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均有显著统计学差异(P＜0.05);异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均有显著统计学差异(P＜0.05);8周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞数值比较均无显著统计学差异(P＞0.05);自体骨组与异种骨融合器组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值相比较均无显著统计学差异(P＞0.05);异种骨融合组与阴性对照组之间CD4+及CD8+T淋巴细胞值比较均无显著统计学差异(P＞0.05)。
　　4、CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞测定结果1周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异（P＞0.05），异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异（P＞0.05），异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异（P＞0.05）;2周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P＜0.05)，异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异（P＜0.05），异种骨融合器组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较，均无显著统计学差异(P＞0.05);4周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异（P＜0.05）;异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P＜0.05);异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均有显著统计学差异(P＜0.05);8周时，自体骨组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异（P＞0.05），异种骨融合器组与阴性对照组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P＞0.05)，异种骨融合组与自体骨组之间CD4+/IL-2+T淋巴细胞及CD4+/IL-4+T淋巴细胞数目比较均无显著统计学差异(P＞0.05)。
　　结论:
　　1、异种骨椎间融合器植入羊体内后早期会引起免疫排斥反应导致CD4+及CD8+T细胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T细胞升高，4W左右最显著，随后逐渐下降，8周时CD4+及CD8+T细胞及CD4+/IL-2+T及CD4+/IL-4+T细胞数量逐渐接近正常。
　　2、手术创伤，疼痛可以引起山羊体内的应激反应导致体内CD4+/IL-2+T细胞及CD4+/IL-4+T细胞数目升高，这种效应术后就开始，2周开左右达到最高，可以维持到术后4周左右，然而这种应激反应却不能引起CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞的升高。

目录

摘要

英文缩略词表

前言

第一章 生物型异种骨生物相容性细胞学研究

1 材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方弦

2 结果

2．1 异种松质骨电镜扫描三维结构观察

2．2 成骨细胞形态观察和功能分析

2．3 成骨细胞增殖活性

2．4 成骨细胞碱性磷酸酶(ALP)测定结果

2．5 流式细胞术检测成骨细胞周期

2．6 成骨细胞的迁移能力

2．7 细胞凋亡结果

2．8 急性溶血实验结果

3 讨论

3．1 超临界二氧化碳(CO2)处理异种骨技术特点

3．2 异种骨生物相容性及成骨性

4 结论

第二章 生物型异种骨生物相容性免疫学研究

1 实验材料和方法

1．1 实验材料

1．2 动物实验模型的建立

2 结果

2．1 动物的—般情况

2．2 大体标本观察

2．3 免疫学分析

3 讨论

3．1 异种骨移植免疫反应

3．2 CD4+T淋巴细胞及CD8+T淋巴细胞数目测定结果分析

3．3 CD4+／IL-2+T淋巴细胞及CD4+／IL-4+T淋巴细胞数目测定结果分析

4 结论

参考文献

综述 骨移植材料研究的现状及进展

致谢

博士研究生期间发表论文情况

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