选择性识别生物重要分子的荧光探针的合成及其生物活性

摘要

生物体内有众多活性分子，生物小分子有各种氨基酸以及阴阳离子等，面生物大分子有核酸、蛋白质等，这些生物分子在生物体内都扮演着非常重要的角色。
　　生物小分子，例如半胱氨酸(Cys)、同型半胱氨酸(Hcy)以及还原型谷胱甘肽(GSH)等。体内半胱氨酸含量的下降将会导致头发褪色、组织浮肿、肝脏损伤、皮肤损害以及生长过慢等诸多病症;同型半胱氨酸为体内甲硫氨酸代谢的中间产物，其含量升高可能会引起心血管疾病、骨质疏松和阿尔茨海默氏病;而还原型谷胱甘肽对维持细胞内的氧化还原平衡状态起着非常重要的作用。萘酰亚胺类衍生物具有良好的光学及化学稳定性、较大的斯托克斯位移以及较高的荧光量子产率。因此，这类物质被广泛用于工业荧光染色、激光材料、光电转换材料、荧光标记以及荧光探针等方面。萘酰亚胺类荧光探针种类繁多，其中4-位取代化合物容易制备和修饰，人们对其研究最为广泛，例如4-氨基-1，8-萘酰亚胺。事实上，3-氨基取代或者3，6-二氨基取代的1，8-萘酰亚胺同样具有很强的荧光，但是这类探针的报道相对较少。
　　生物大分子，例如核酸、蛋白质等。核酸作为遗传物质，其结构、功能以及化学修饰等均与基因表达、蛋白质合成以及细胞信号传导等生命过程密切相关。而G-四链体是特殊的DNA二级结构，它在细胞的生长、增殖、凋亡以及肿瘤的形成和发展中起着重要的作用。人端粒DNA是染色体末端由DNA重复序列TTAGGG组成的双螺旋区，其末端是含有100-200 nt（核苷酸）的富G碱基的单链悬突，这些富G的单链悬突在一定条件下可形成G-四链体。近些年来大部分关于G-四链体的研究都集中在单倍体G-四链体，而实际上端粒末端悬突由100-200 nt的长链端粒DNA序列组成，虽然它们大多数形成单倍体G-四链体，但是仍有少数可以形成更复杂的由TTA碱基序列连接的双倍体或多倍体G-四链体结构。研究表明一些疾病如ALS病、脆性X综合征等与多倍体G-四链体有关，因此选择性识别双倍体或多倍体G-四链体有助于更好地理解G-四链体的结构和功能，为开发出以G-四链体为靶点的抗肿瘤药物提供有效指导。
　　荧光探针具有选择性好、灵敏度高、操作简单以及能实现实时监测等优点，它们能够实时观测生物分子在体内的含量、分布以及代谢，所以用其来研究生物分子在体内所发挥的作用具有非常重要价值。因此开发出高选择性高灵敏度的荧光探针来检测这些生物分子具有重要的意义。
　　目的：
　　本论文开展了生物小分子硫醇和生物大分子-双倍体G-四链体荧光探针的研究，具体如下:
　　方法：
　　以3，6-二氨基-1，8-萘酰亚胺为荧光团母体，以2，4-二硝基苯磺酰基为反应识别基团，基于磺酰胺键断裂设计并合成了选择性识别含巯基氨基酸的探针化合物1，并用低分辨质谱、高分辨质谱、1H NMR和13C NMR进行了结构表征。生物活性研究表明:化合物1能选择性识别含巯基氨基酸，而且有很好的抗干扰能力;相对于GSH和Hcy，化合物1对Cys显示出最高的荧光检测灵敏度，其检测限达到2.0×10-7 M;化合物1与Cys、GSH和Hcy的假一级反应速率常数分别为3.0×10-2 min-1，9.5×10-3 min-1和5.9×10-3 min-1，表明化合物1对小分子生物硫醇Cys具有更高的识别速率;质谱及核磁共振实验验证了探针1的反应机理为磺酰胺键断裂的反应机理，与硫醇发生亲核取代反应后，ICT机制受阻，荧光恢复;探针1成功用于检测人肝癌细胞(HepG2)中的含巯基氨基酸。综上所述，化合物1是一个优良的小分子生物硫醇探针。设计并合成了二乙二醇连接的双小檗碱衍生物2，并用低分辨质谱、1HNMR和13C NMR进行了结构表征。
　　结果:
　　化合物2能对G-四链体产生荧光响应，而且对双倍体G-四链体(G2T1)的荧光响应明显强于单倍体G-四链体(G1)，对反平行G-四链体的荧光响应优于混合型G-四链体;化合物2对反平行G2T1、反平行G1、混合型G2T1和混合型G1的最低检测限分别为7.8×10-10 M、9.6×10-9 M、2.16×10-9 M和1.23×10-8 M，表明化合物2对双倍体G-四链体的检测灵敏度高于单倍体G-四链体，并且对反平行双倍体G-四链体的检测灵敏度高于混合型双倍体G-四链体;紫外滴定实验得到化合物2与反平行G2T1、反平行G1、混合型G2T1和混合型G1的表观结合常数，分别为9.59×106M-1、4.99×105M-1、6.10×108M-1和1.47×106M-1，说明化合物2与双倍体G-四链体的结合能力强于单倍体G-四链体，并且与混合型双倍体G-四链体的结合能力强于反平行双倍体G-四链体。非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验进一步表明化合物2与双倍体G-四链体的结合能力强于单倍体G-四链体。
　　结论：
　　与中间更长聚醚链的双小檗碱化合物I18相比，两种化合物对反平行双倍体G-四链体的检测限以及结合能力基本相当（化合物I18与反平行双倍体G-四链体的检测限和表观结合常数分别为6.5×10-10M和2.0×107 M-1），说明化合物2同样是一个优良的双倍体G-四链体结合剂和荧光探针。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 引言

1．2 荧光探针的识别原理

1．2．1 光诱导电子转移(Photoinduced Electron Transfer，PET)

1．2．2 分子内电荷转移(Intramolecular Charge Transfer，ICT)

1．2．3 荧光共振能量转移(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)

1．3 萘酰亚胺类荧光探针

1．3．1 萘酰亚胺类荧光探针对阴离子的识别

1．3．2 萘酰亚胺类荧光探针对阳离子的识别

1．3．3 萘酰亚胺类荧光探针对生物小分子的识别

1．3．4 萘酰亚胺类荧光探针对生物大分子的识别

1．4 G-四链体荧光探针

1．4．1 G-四链体结构

1．4．2 G-四链体生物学功能

1．4．3 单倍体G-四链体荧光探针研究进展

1．4．4 双倍体或多倍体G-四链体荧光探针研究进展

1．5 本论文的主要研究内容及意义

参考文献

第二章 1，8-萘酰亚胺类荧光探针的合成及其对生物硫醇的识别活性研究

2．1 目标化合物的设计

2．2 实验部分

2．2．1 实验仪器与试剂

2．2．2 化合物1的合成

2．2．3 活性实验方法

2．3 结果与讨论

2．3．1 1，8-萘酰亚胺类荧光探针化合物1的合成及表征

2．3．2 化合物1对含巯基氨基酸的荧光响应

2．3．3 pH值对化合物1检测Cys的影响

2．3．4 化合物1对氨基酸的选择性

2．3．5 干扰物质对化合物1检测Cys的影响

2．3．6 化合物l对含巯基氨基酸的检测限研究

2．3．7 化合物1与含巯基氨基酸的反应动力学研究

2．3．8 荧光量子产率

2．3．9 反应机理验证

2．3．10 探针在人肝癌细胞(HepG2)中激光扫描共聚焦成像

2．4 结论

参考文献

第三章 醚链连接的双小檗碱衍生物的合成及其对双倍体G-四链体的识别活性研究

3．1 目标化合物的设计

3．2 实验部分

3．2．1 实验仪器与试剂

3．2．2 化合物2的合成

3．2．3 活性实验方法

3．3 结果与讨论

3．3．1 化合物2的合成与结构表征

3．3．2 荧光滴定实验

3．3．3 荧光拍照实验

3．3．5 检测限实验

3．3．6 紫外滴定实验

3．3．7 非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

3．4 结论

参考文献

第四章 全文总结与展望

附录

在校期间发表的论文

致谢

声明