ERCC2 rs13181基因多态性与胶质瘤易感性关系及相关机制研究

摘要

本文分为以下两个部分进行探讨：
　　第一部分:ERCC2 rs13181基因多态性在胶质瘤易感性关系的研究
　　目的：
　　本研究是通过研究ERCC2 rs13181多态性与脑胶质瘤易感性的关系，进一步说明ERCC2rs13181与胶质瘤发生发展的关系。
　　方法：
　　研究对象
　　胶质瘤患者组:实验收集经组织病理确诊为胶质瘤患者资料，本研究中共有165例脑胶质瘤患者，根据世界卫生组织(WHO)的分类分级。
　　对照组:随机选择330例同期我院门诊患者和体检健康者无脑胶质瘤患者，并排除与癌症或中枢神经系统相关的疾病和先前接收放疗和化疗其他疾病患者。
　　对研究对象，设定调查相关内容，包括以下几方面:
　　研究对象的一般情况，如性别、年龄、婚姻、爱好、健康情况、家庭经济状况等;
　　1.外界环境与胶质瘤相关的重要危险因素;
　　2.主要危险因素，包括家族肿瘤史，颅脑损伤，颅内感染等与胶质瘤发生密切相关的疾病史等。
　　收集两组的外周血标本，提取DNA后用PCR反应扩增ERCC2 rs13181基因序列，再采用限制性片段长度多态性聚合酶链反应(Polymerase ChainReaction-Restriction Fragment Length Polymorphism PCR-RFLP)的方法对PCR反应产物进行基因型分析。
　　统计学处理
　　1.Hardy-Weinberg平衡检验:在进行关联分析之前，要先进行Hardy-Weinberg平衡检验，等位基因A1、A2的频率分别为p和q，(p+q)2=p2+2pq+q2=1，p2为野生型基因型频率，2pq为杂合型基因型频率，q2为突变纯合型基因型频率，假设前提为为以群体处于Hardy-Weinberg平衡状态，采用x2检验进行检验，确认研究样本的群体代表性。
　　2.危险因素分析:采用SPSS18.0对数据进行分析，实验结果以均数±s表示，两组间比较均数差异的显著性检验用t检验，p＜0.05被认为有统计学差异。采用x2检验及t检验进行分析。
　　3.等位基因频率、基因型频率分析:采用Logistic回归分析。
　　4.分层分析ERCC2 rs13181与环境因素的交互作用。
　　结果：
　　胶质瘤组与对照组相比，性别、吸烟、饮酒、肿瘤家族史无明显差异;在共显性模型和隐性模型中，ERCC2 rs13181GG型增加胶质瘤的风险;环境因素（包括年龄，性别，吸烟和饮酒等因素）对ERCC2 rs13181多态性与胶质瘤的风险没有影响。
　　结论：
　　在共显性模型和隐性模型中，ERCC2 rs13181GG型增加了脑胶质瘤的风险，这表明该基因多态性可能影响脑胶质瘤的病因相关。然而，需要具有更大的样本量的研究来证实这些发现。
　　第二部分:基于过表达胶质瘤细胞模型研究ERCC2对胶质瘤细胞生物学功能的初步研究
　　目的：
　　通过研究ERCC2基因对胶质瘤细胞体外生物学效应，及p53、c-myc和cdK2表达的影响，初步分析ERCC2基因与胶质瘤发生发展的机制。
　　方法：
　　研究对象
　　将第一部分实验所获得的野生型ERCC2(ERCC2 rsl3181TT)的DNA扩增产物与pcDNA3.1质粒（美国Invitrogen公司）混合在一起，然后用限制性内切酶进行双酶切。酶切产物切胶回收后用高效DNA连接酶:16℃连接16h;将连接产物转化至E.coli DH5α感受态细菌。使用G418平板筛选，挑取阳性克隆，摇菌过夜，最后提取质粒。将构建的重组质粒命分别命名为pcDNA3.1/ERCC2。将pcDNA3.1/ERC C2转染入人胶质瘤U251细胞，同时将空质粒pcDNA3.1转染的人胶质瘤U251细胞和未转染的人胶质瘤U251细胞作为对照组。
　　统计学处理
　　SPSS18.0统计软件行组间方差分析，以P＜0.05为差异有显著性，结果以Mean±SD表示。
　　结果：
　　1.体外转染细胞模型构建成功
　　2.各组中ERCC2 mRNA和蛋白的表达情况，RT-PCR检测结果发现，与对照组相比，pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2表达量明显增加。经过WesternBlot检测发现，与对照组相比，pcDNA3.1-ERCC2组细胞中ERCC2蛋白翻译明显增加。
　　3.转染48 h后的各组细胞，分别采用AnnexinⅤ-PI双染法，通过流式细胞仪检测细胞凋亡率。采用WinMDI2.9软件对各组的凋亡率进行分析各组的凋亡率，统计学分析P＜0.01，有显著的意义。
　　4.Cell Counting Kit-8(CCK8)方法检测各组细胞增殖水平的变化。分别在细胞转染的第24小时，第48小时和第72小时收集细胞培养悬液，用分光光度计测定450nm吸光度(A450)，测得各个时间点的吸光度值。我们发现pcDNA3.1-ERCC2组细胞细胞增殖受到抑制，48小时(p＜0.05);72小时(p＜0.001)。
　　5.各组中p53、c-myc和cdk2等相关分子的表达情况。经过研究发现，与对照组相比，pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53表达量明显增加，C-myc、 cdk2表达量明显下降。经过Western Blot检测结果，与对照组相比，pcDNA3.1-ERCC2组细胞中p53蛋白表达量明显增加，C-myc、 cdk2蛋白表达量明显下降。
　　结论：
　　ERCC2可以主要阻滞细胞周期进程，诱导胶质瘤细胞凋亡，抑制细胞活性，上调p53的表达，抑制c-myc和cdK2的表达。我们进一步推测，ERCC2基因可能为胶质瘤的基因治疗提供新的思路。

目录

摘要

前言

参考文献

第一部分 ERCC2rs13181基因多态性在胶质瘤易感性关系的研究

前言

一、对象与方法

二、结果

三、讨论

结论

参考文献

第二部分 基于转染胶质瘤细胞模型研究ERCC2对胶质瘤细胞生物学功能的影响

前言

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

四、结论

参考文献

综述

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致谢

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