常用实验动物与人肠道、口腔、生殖道微生物组比较

摘要

目的：采用基于细菌16S rRNA高通量测序法，研究几种常用实验动物（西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠）的菌群结构以及它们各自的特点和差异性，并和正常人的数据进行比对分析，初步讨论常用实验动物与人有关菌群的差异和相似性，以此为人体微生态方面的医学研究提供基础性资料，并为在选择研究微生态使用的实验动物模型时提供一些参考。
　　方法：第一章 肠道菌群样品采集及数据分析
　　采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠新鲜粪便，收集于EP管中，每个品种4只（成年），雄性1只，雌性3只;共20个样品，-20℃保存。
　　经粪便样品基因组DNA提取后，用细菌16S rRNA通用引物，PCR扩增样品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq2000平台进行PE100-bp测序后，得到高通量下的原始数据序列，高通量测序数据用BIPES(Barcoded Illumina Paired-end(PE) Sequencing)流程进行初步原始序列处理，采用分阶段聚类算法Two-Stage-Clustering(TSC)将干净序列聚类成操作分类单元(Operational Taxonomic Units，OTUs)， OTU聚类过程中主要采用三种距离法:最远距离法、最近距离法、平均距离法。对于获得的OTUs，使用GAST(GlobalAlignment for Sequence Taxonomic)算法对其进行分类。
　　第二章 口腔菌群样本采集及数据分析
　　用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠新鲜口腔菌群样品，每个品种4只（成年），雄性1只，雌性3只;共20个样品，-20℃保存。
　　第三章 生殖道样本采集及数据分析
　　用一次性棉拭子采集东莞松山湖明珠实验动物科技有限公司西藏小型猪、南方医科大学实验动物中心比格犬、猕猴生殖道菌群样品，每个品种3只（成年），-20℃保存。人的生殖道菌群数据由南方医科大学公共卫生与热带医学学院提供。经过细菌总DNA提取后，用细菌16S rRNA通用引物，PCR扩增样品的16S rRNA V4区。将PCR终产物经过Illumina Hiseq2000平台进行PE100-bp测序后，得到高通量下的原始数据序列，数据的处理方法与第一章相同。
　　结果：第一章 肠道菌群结构分析
　　1、α多样性分析中，PD_whole_tree指数，人与西藏小型猪、猕猴的差异显著(P＜0.05)，西藏小型猪与猕猴、比格犬、新西兰大白兔、Wistar大鼠差异显著(P＜0.05)，其余物种间均无显著差异(P＞0.05);Shannon指数，人和西藏小型猪差异显著(P＜0.05)，西藏小型猪与比格犬、新西兰大白兔差异显著(P＜0.05)，其余物种间均无显著差异(P＞0.05)。
　　2、β多样性分析表明，比格犬的未加权UniFrac距离和人最接近，西藏小型猪的加权UniFrac距离和人的距离最近，菌群相似度最高。
　　3、菌群结构门水平中，西藏小型猪与人的肠道菌群门结构水平最为相近。菌群结构属水平中，人的肠道菌群中拟杆菌属（Bacteroides）的比例最高，其次为普氏菌属（Prevotella）、栖粪杆菌属（Faecalibacterium）、罗斯氏菌属（Roseburia）及梭杆菌属（Fusobacterium），占人肠道菌群的60％以上。猪、猴、鼠的肠道菌群中普氏菌属（Prevotella）均占有较大比例，但是猪的肠道菌群主要以普氏菌属（Prevotella）、梭杆菌属（Fusobacterium）及密螺旋体属（Treponema）为主;猴的肠道菌群以乳酸杆菌属（Lactobacillus）、颤杆菌克属（Oscillibacter）为主;鼠的肠道菌群以普氏菌属（Prevotella）、贪噬菌属（Variovorax）为主。犬的肠道菌群以鞘氨醇单胞菌（Sphingomonas）、梭杆菌属（Fusobacterium）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主。兔的肠道菌群以拟杆菌属（Bacteroides）、瘤胃球菌属（Ruminococcus）、乳酸杆菌属（Lactobacillus）为主。
　　第二章 口腔菌群结构分析
　　1、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠样品20个及人口腔样品15个，质控后获取了939272条干净的16S rRNA基因序列，获得的最低基因序列为101条，35个样品全部纳入后续分析。
　　2、α多样性分析表明，人、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠口腔菌群Shannon指数均无显著差异(P＞0.05)。人与猪、犬、猴、兔、大鼠差异显著(P＜0.05)，猪与犬、猴、兔差异显著(P＜0.05)，其他均无显著差异(P＞0.05)。
　　3、β多样性分析表明，未加权UniFrac距离比较中，西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠的口腔菌群的丰富度比较相近，这可能是由于实验动物特定的生活环境造成的;相对而言，猴和猪与人的距离较为接近，表明猴和猪与人的口腔菌群菌落的相似度高于其他物种。加权UniFrac距离中，考虑到丰度的关系，猴和人距离较近，相似度较高。
　　4、人的口腔菌群门结构水平中有五个门的细菌占主要地位，分别是:放线菌门（Actinobacteria），厚壁菌门（Firmicutes），变形菌门（Proteobacteria），拟杆菌门（Bacteroidetes）和梭杆菌门(Fusobacteria)。猪、犬、猴、兔、大鼠口腔菌群门结构水平均以变形菌门（Proteobacteria）和厚壁菌门（Firmicutes）为主，占50％以上，猪、猴、大鼠的门结构水平较为相似，都有放线菌门(Actinobacteria)、拟杆菌门（Bacteroidetes）、厚壁菌门（Firmicutes）。相比较而言，猪的口腔菌群门水平更接近人。不同物种口腔菌群在属水平上存在差异较大，五个物种都有奈瑟氏菌属（Neisseria）、罗氏菌属（Roseburia）、卟啉菌属（Porphyromonas）、莫拉氏菌属（Moraxella），口腔链球菌属(Streptococcus)、放线茵属（Actinobacillus）、梭杆菌属（Fusobacterium）、乳酸杆菌属(Lactobacillus)。
　　第三章 生殖道菌群结构分析
　　1、西藏小型猪、比格犬、猕猴样品9个与30～50岁健康人群的样品10个，共19个样品质控后获取了135191条干净的16S rRNA基因序列，获得的最低基因序列为1935条，19个样品全部纳入后续分析。
　　2、α多样性分析表明，各物种间均无统计学意义，说明猪、犬、猴和人的生殖道菌群无显著差异(P＞0.05)。
　　3、β多样性分析亦表明，猪、犬、猴和人的生殖道菌群无显著差异（P＞0.05）。
　　4、人、猪、犬、猴生殖道菌群门水平均以厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门(Actinobacteria)为主。其中西藏小型猪与人的生殖道菌群门结构水平较为相近，厚壁菌门（Firmicutes）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、变形菌门（Proteobacteria）、放线菌门（Actinobacteria）占所有菌群门水平的90％以上，犬和猴的门结构水平较为相似，梭杆菌门(Fusobacteria)占10-20％以上。四个物种的属水平分布大不相同。但总的看来人的生殖道菌群中含有的普雷沃菌属(Prevotella)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、链球菌属（Streptococcus）、厌氧球菌属（Anaerococcus）、梭杆菌属（Fusobacterium）在猪、犬、猴的生殖道菌群中都有出现。
　　结论:1、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠与人的肠道菌群在属水平上存在较大差异，西藏小型猪和猕猴可能是适合做饮食结构相关的研究的模型动物，猕猴可能是适合做关节炎及与肥胖疾病相关的模型动物，比格犬可能是适合做与慢性消化系统疾病相关的模型动物。
　　2、西藏小型猪、比格犬、猕猴、新西兰大白兔、Wistar大鼠与人的口腔菌群结构各不相同，在菌群的丰富度和相似程度上，猴最接近人。猴可能是研究与梭杆菌门相关口腔疾病较适宜的动物模型，猪可能是与变形菌门相关口腔感染性疾病较为合适的模型动物，犬可能是研究与螺旋体门相关的慢性牙周病较为合适的模型动物。
　　3、西藏小型猪、比格犬、猕猴生殖道菌群与人从菌群丰富度和多样性上均无显著差异，猴可能是研究与普氏菌属相关的阴道感染性疾病较为合适的模型动物，猪可能是研究与链球菌或不动杆菌相关的细菌性阴道炎较为合适的模型动物，犬可能是研究与乳酸杆菌属相关疾病的模型动物。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 常用实验动物与人肠道茵群比较

2．1 材料

2．1．1 试剂与耗材

2．1．2 仪器

2．2 方法

2．2．1 样品采集

2．2．2 粪便样品基因组DNA提取

2．2．3 细菌16S rRNA V4区域扩增

2．2．4 Illumina solexa测序

2．2．5 数据分析

2．3 结果

2．3．1 测序与质量控制

2．3．2 常用实验动物与人肠道菌群之比较

2．4 讨论

2．5 小结

第三章 常用实验动物与人口腔菌群比较

3．1 材料

3．1．1 试剂与耗材

3．1．2 仪器

3．2 方法

3．2．1 样本采集

3．2．2 细菌总DNA提取

3．2．3 16S rRNA基因扩增

3．2．4 Illumina solexa测序

3．2．5 数据分析

3．3 结果

3．3．1 测序与质量控制

3．3．2 实验动物与人口腔菌群结构比较

3．4 讨论

3．5 小结

第四章 常用实验动物与人生殖道菌群比较

4．1 材料

4．1．1 试剂与耗材

4．1．2 仪器

4．2 方法

4．2．1 样本采集

4．2．2 细菌总DNA提取

4．2．3 16S rRNA基因扩增

4．2．4 数据分析(同2．2．5)

4．3 结果

4．3．1 测序与质量控制

4．3．2 常用实验动物与人生殖道菌群比较

4．4 讨论

4．5 小结

全文小结

参考文献

附录

致谢

声明