兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌的血管生成动态变化及HIF-1α、VEGF、MMP-9在肝癌超声消融后残癌的发生发展中的作用

摘要

本文从以下几部分进行论述：
　　第一部分:组织块埋植法造模荷瘤肝癌兔
　　目的:
　　通过组织块埋植法造模荷瘤肝癌兔，为进一步实验操作奠定理想的动物模型。
　　方法:
　　本次研究主要采用随机分组法选取由内蒙古医科大学动物中心提供的清洁级新西兰白兔110只，6-7月龄，体质量为2300克，不限雌雄。
　　观察实验兔一般状况，并用实时多普勒彩色超声诊断系统GE-Logiq-E8，探头频率为3.0-5.0MHz，测量种植肿瘤直径大小，取其中5只兔处死做肝癌标本的病理组织切片，观察其病理变化。
　　结果:
　　1.105只实验兔，其中4只由于手术感染，或者造模过程中手术操作失误，或由于术后不明原因死亡，种植肿瘤后存活101只，在用超声对存活实验兔进行肝脏检查时发现，其中有3只在肝脏区域不能观察到肿瘤组织高回声区域，分析其可能由于手术操作过程失误或者种植肿瘤组织块失活造成。
　　2.其余98只存活荷瘤肝癌兔，其测量肿瘤大小为2.3±0.32cm，肝癌的超声检查显示，包膜可以完整，也存在不完整的个别案例，肿瘤实质内有高回声显现，周围暗环较宽，也有个别较窄，其主要是由于肿瘤组织推开周围小血管而形成周围血管围绕征，肝癌结节后方回声常无明显变化，也有后方局部增强，个别动物模型还能观察到临近组织有肿块。
　　3.在肝癌种植成功98只兔中随机选取5只，并处死，肝癌病理组织学切片形态学观察无差异，均表现为肝细胞癌样变化。呈现明显的肝癌病理组织形态，常伴有巨核和多核瘤细胞，细胞核大小、形状和染色不一，染色质多呈粗颗粒状，分布不均匀，核膜肥厚，核仁分裂，核分裂呈不对称性，包浆多呈嗜碱性。
　　结论:
　　1.本研究成功通过组织块埋植法建立了98只造模荷瘤肝癌兔。
　　2.造模荷瘤肝癌兔肝癌病理组织观察符合肝癌病理特征。
　　3.造模荷瘤肝癌兔肝癌超声观察符合肝癌超声影像学特征。
　　4.成功造模模型为下一步研究肝癌射频消融疗效及复发奠定了基础。
　　第二部分:兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌的血管生成超声造影与血流信号相关性研究
　　目的:
　　本研究主要通过动物实验连续动态观察超声消融治疗后兔肝残癌的微血管形态学（超声造影观察）和血流信号的变化，从形态结构上研究消融治疗后肝癌复发的过程，为超声消融后局部肿瘤复发的临床治疗奠定基础。
　　方法:
　　将第一部分实验造模成功的荷瘤肝癌兔随机选取90只，分为3大组，9小组，对照组10只，射频消融10％肿瘤残留组40只，再按治后选取不同时间将射频消融10％肿瘤残留组分组手术切除10％肿瘤残留组进行常规肝脏肿瘤残存10％切除术，缝合腹壁，抗炎治疗。三组白兔在治疗后0天、3天、7天、14天通过超声造影观察残癌的微血管生成的动态变化，超声造影过程中保证对每例白兔检查全部参数不变（机械指数、增益及深度），超声检查肿瘤大小、血流信号分级，按照数字由低到高分为0、1、2、3共四级，0级，肿瘤组织未发现血流信号，血流活动等级为零;1级，肿瘤组织存在星点状短的血流信号，分布较少，时而出现，时而消失;2级肿瘤组织中存在连续的线条状血流信号，具有一定的连续血流活动;3级肿瘤组织中有较粗大血管通过，血流速度很快。
　　结果:
　　射频消融后进行超声影像学检查，在消融术后即刻检查可见在消融区域周围有气化回声，边界形态较为模糊，分辨不清，出现1级血流，基本检测不到血流，消融治疗术后3天肿瘤边界大小与消融治疗前相似，边界模糊，消融区出现高回声，消融区域边缘血流信号为1级，基本检测不到血流。7天到14天进行超声检查，边界逐渐清晰，消融区出现高回声或者是中高混合回声，血流信号为2-3级。
　　超声造影显示，射频消融前，肝癌周围显影迅速增高，持续5-8秒，接着20秒左右周围显影随即消失;射频消融后0天、3天，注射造影剂15秒后，肿瘤周围出现血流信号，肝癌区域出现缺损区，内部未见血流信号;射频消融后7天、14天，以前的血流缺损区出现血流强化，7天组，有2例出现血流强化，14天组有4例血流强化灶。
　　射频消融后进行病理观察，手术区域大部分组织坏死，核固缩，凝集，呈深蓝色，染色质崩裂，呈碎屑，核膜溶解，不见细胞核轮廓，细胞间质内肿胀液化。术后7天和14天后，射频消融区域出现液化，坏死范围进一步扩大，液化区域周围出现纤维化。
　　结论:
　　1.射频消融可以杀死部分肿瘤灶，但随着术后时间延长，射频消融10％肿瘤残留组超声血流信号比手术切除10％肿瘤残留组高。
　　2.射频消融可以杀死部分肿瘤灶，但随着术后时间延长，射频消融10％肿瘤残留组超声血管造影血流强化比手术切除10％肿瘤残留组高。
　　第三部分:兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌血流信号与血管生成的关系研究
　　目的:
　　本研究主要通过动物实验连续动态观察超声消融治疗后兔肝残癌组织MVD与VEGF、MMP-9变化，探讨其与血流信号相关性，从分子机制上研究消融治疗后肝癌复发的过程，为超声消融后局部肿瘤复发的临床治疗奠定基础。
　　方法:
　　采取S-P法对肝癌组织VEGF、MMP-9表达进行检测，家兔的多克隆抗体用于VEGF、MMP-9表达的染色。用图像分析软件随机取每张切片五个高倍镜视野测定平均光密度值并进行统计学分析。
　　结果:
　　将相同时间下射频消融10％肿瘤残留组与手术切除10％肿瘤残留组两两比较，P＜0.05，差异均有统计学意义。
　　将相同时间下射频消融10％肿瘤残留组与手术切除10％肿瘤残留组两两比较，P＜0.05，差异均有统计学意义。
　　对照组中，血流信号分级与VEGF、MMP-9的表达及MVD值正相关，相关系数分别为0.521、0.768、0.814，P均小于0.05，射频消融10％肿瘤残留组和手术切除10％肿瘤残留组各个时间段血流信号与VEGF、MMP-9的表达及MVD值正相关，即随着血流信号升高，VEGF、MMP-9的表达及MVD值均升高;随着时间的延长（7天和14天），射频消融10％肿瘤残留组VEGF、MMP-9的表达及MVD值均大于手术切除10％肿瘤残留组。
　　结论:
　　1.对照组、射频消融10％肿瘤残留组和手术切除10％肿瘤残留组超声血流信号与血管生成相关因子VEGF、MMP-9的表达和MVD值呈正相关。
　　2.射频消融比手术切除更易发生肿瘤的复发。
　　3.临床对射频消融术后肝癌复发可以通过超声影像血流分级结合血管生成相关因子进行综合判断以指导预后。
　　第四部分:兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达与血流信号相关性研究
　　目的:
　　本部分研究主要是通过动物实验连续动态观察超声消融治疗后残癌HIF-1α、VEGF、MMP-9mRNA和蛋白表达变化，探讨其与血流信号相关性，从分子机制上研究消融治疗后肝癌复发的过程，为超声消融后局部肿瘤复发的临床治疗奠定基础。
　　方法:
　　1.组织标本免疫组化检测HIF-1α
　　采取S-P法对肝癌组织HIF-1α表达进行检测，家兔的多克隆抗体用于HIF-1α表达的染色。用图像分析软件随机取每张切片五个高倍镜视野测定平均光密度值并进行统计学分析。
　　2.各组肝癌组织标本IF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA佥测
　　实时荧光定量PCR(RT-qPCR)对HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA水平进行定量，实验选用SYBR PrimeScript RT-qPCR试剂盒(TaKaRa, Tokyo，Japan)，并以β肌动蛋白作为内参。
　　3.各组肝癌组织标本IF-1α、VEGF、MMP-9蛋白检测
　　所选组织样本的HIF-1α、VEGF、MMP-9蛋白水平通过蛋白印迹试验进行分析。肿瘤样本在蛋白分离前进行了均一化处理。
　　结果:
　　将相同时间下射频消融10％肿瘤残留组与手术切除10％肿瘤残留组两两比较，P＜0.05，差异均有统计学意义。
　　将相同时间下射频消融10％肿瘤残留组与手术切除10％肿瘤残留组两两比较，P＜0.05，差异均有统计学意义。
　　将相同时间下射频消融10％肿瘤残留组与手术切除10％肿瘤残留组两两比较， P＜0.05，差异均有统计学意义，射频消融10％肿瘤残留组HIF-1α、VEGF、MMP-9蛋白水平低于对照组，但比手术切除10％肿瘤残留组高。
　　对照组中，血流信号与HIF-1αmRNA和蛋白表达呈负相关，与VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表达值正相关。
　　结论:
　　1.对照组、射频消融10％肿瘤残留组和手术切除10％肿瘤残留组血流信号与血管生成相关因子VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达呈正相关，与HIF-1αmRNA和蛋白表达呈负相关。
　　2.射频消融比手术切除更易发生肿瘤的复发。
　　3.HIF-1α、VEGF、MMP-9的mRNA和蛋白表达对于指导临床射频消融术后肝癌复发具有重要的价值，同样也可作为干扰肝癌复发的药物作用靶点。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 背景

1．2 研究目的及意义

1．3 本研究的创新性

参考文献

第一部分 组织块埋植法造模荷瘤肝癌兔

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4小结

参考文献

第二部分 兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌的血管生成超声造影与血流信号相关性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第三部分 兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌血流信号与血管生成的关系研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

第四部分 兔肝癌模型射频消融和手术切除后残癌HIF-1α、VEGF、MMP-9 mRNA和蛋白表达与血流信号相关性研究

1 材料和方法

2 结果

3 讨论

4 结论

参考文献

全文小结

综述 射频消融治疗肝癌研究综述

中英文缩写词对照表

致谢

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