致癌基因FOXK1通过诱导EMT促进结直肠癌细胞的侵袭转移

摘要

本文主要从以下几部分展开论述：
　　第一章:FOXK1在结肠癌中的表达与临床相关性的研究
　　目的:
　　本课题以组织芯片、免疫组化、Western、qRT-PCR、稳定表达株构建技术、双荧光素酶基因报告检测系统、生存分析等实验手段。对FOXK1的人体肿瘤组织（包括结直肠癌）中表达情况进行具体检测，进一步证实FOXK1在结直肠癌中癌基因的作用。围绕FOXK1在结肠肿瘤中的表达强弱及其与临床特点、生存率的关系进行探讨，继而为结肠癌的基因治疗提供帮助。
　　方法:
　　1、FOXK1在15类正常及肿瘤组织中的表达情况
　　2、FOXK1在结直肠癌组织及细胞中的表达情况
　　3、过表达FOXK1对结直肠癌细胞内癌基因表达的影响
　　4、FOXK1在结直肠癌组织中的表达与临床特点及预后的关系
　　5、数据的统计学处理
　　双荧光素酶报告基因检测、qRT-PCR结果用三或两次实验结果先进行方差齐性检验，方差齐(P＞0.05)则进行两个处理组间独立样本t检验或多个处理组间one way ANOVA统计分析，整体比较有显著性差异后多重比较采用LSD法;方差不齐(P＜0.05)则应用Satterthwaite近似t检验或Welch检验分析，整体比较有显著性差异后多重比较采用Duunett's T3检验。通过免疫组织化学的得分判断FOXK1的表达高低与临床病理（多个处理组）特点运用两样本率比较采用四格表资料的x2检验，多样本率的比较采用行列表资料的x2检验，如果某一个分组的样本特别小，相关性分析则采用Fisher's精确检验，生存分析方法采用log-rank检验。
　　结果:
　　1、FOXK1在多数正常组织中不表达，在肿瘤组织中均表达增高
　　2、FOXK1在结直肠癌组织及细胞中均呈高表达
　　2.1、FOXK1在原发性结直肠癌组织中表达增高
　　2.2、FOXK1在7个结直肠癌细胞系中均有表达
　　3、过表达FOXK1促进肠癌细胞内癌基因的启动子活性及mRNA水平的表达
　　3.1、Western blotting及qRT-PCR证实成功构建了pcDNA3.1-FOXK1-SW480及pcDNA3.1-SW480的稳定表达细胞株。
　　3.2、过表达FOXK1增加结直肠癌细胞内癌基因mRNA水平的表达
　　3.3、过表达FOXK1后提高结直肠癌细胞内Survivin，Cyclin D1和AP-1的转录活性
　　4、FOXK1的表达与结直肠癌患者7年总体生存率呈负相关
　　结论:
　　1.FOXK1在人体皮肤、睾丸、肾脏、卵巢、前列腺、肺、食管、胰腺、宫颈、大脑、胃、小肠、乳腺、结肠、直肠组织中扮演癌基因的角色;
　　2.过表达FOXK1促进结直肠癌细胞的致癌性;
　　3.FOXK1高表达与结直肠癌患者AJCC分期、TNM分期、肿瘤大小、病理分化程度、是否淋巴结累及相关;
　　4.FOXK1高表达是肠癌患者预后不良的因素之一
　　第二章:FOXK1在肠癌细胞侵袭、转移过程中EMT相关功能的研究
　　目的:
　　本课题将围绕FOXK1在结肠癌细胞侵袭、转移过程中EMT相关机制展开研究。
　　方法:
　　1、评估FOXK1在结直肠原位癌及转移癌的关系
　　2、低表达FOXK1对结肠癌细胞迁移、侵袭的影响
　　3、评估FOXK1表达的变化对结直肠癌细胞EMT的影响
　　4、阐明FOXK1是否可逆转rTGF-β1引起的EMT影响:
　　4.1、评价rTGF-β1对FOXK1、EMT相关蛋白表达的影响
　　4.2、低表达FOXK1阻断rTGF-β1对EMT的作用
　　5、压低FOXK1表达对体内肿瘤侵袭转移作用的影响
　　5.1、构建低表达FOXK1的稳定表达株
　　5.2、脾被膜下肝转移模型的建立
　　结果:
　　1、FOXK1在原发结直肠癌及淋巴结转移癌中均高表达
　　免疫组化结果证实，FOXK1在肿瘤细胞核及肿瘤相关的基质细胞中均呈高表达，即高表达FOXK1的肠癌细胞可以突破基底膜，具有更强的侵袭能力。正常结肠腺体上皮细胞未发现阳性表达。
　　2、低表达FOXK1抑制结直肠癌细胞迁移、侵袭能力
　　2.1、低表达FOXK1序列的验证
　　将FOXK1-siRNA及Scr-siRNA序列瞬时转染结肠癌细胞后，Westernblotting证实转染FOXK1-siRNA的结直肠癌细胞SW480和SW1116均较对照组FOXK1的表达明显压低。
　　2.2、低表达FOXK1抑制结肠癌细胞迁移能力
　　FOXK1-siRNA-SW480组肠癌细胞在划痕实验进行至60小时的迁移比率为52.02±0.087％，对照组SW480细胞已完全汇合。
　　2.3、低表达FOXK1抑制结肠癌细胞侵袭能力
　　压低组FOXK1-siRNA-SW480与对照组Scr-siRNA-SW480相比，Transwell实验计数穿过基底膜的细胞数分别为48.5±4.93和72.5±6.14，压低组FOXK1-siRNA-SW1116与对照组Scr-siRNA-SW1116相比，细胞数分别为61.25±6.65和118.5±15.76，差异具有统计学意义。
　　3、FOXK1表达水平与肠癌细胞EMT相关
　　3.1、过表达FOXK1对结肠癌细胞形态的影响
　　稳定表达株FOXK1-pcDNA3.1-SW480呈现出细长如成纤维细胞的形态，而对照细胞pcDNA3.1-SW480稳定表达株呈现出短圆、平坦的细胞形态。罗丹明结果显示:过表达FOXK1的稳定细胞边缘地带突出，伸出伪足。
　　3.2、FOXK1表达变化对EMT标记物的影响
　　应用间接免疫荧光方法对E-cadherin和Vimentin分别染色，荧光显微镜下观察其细胞分布。绿色荧光偶联Vimentin蛋白，红色荧光偶联E-cadherin，可以看出低表达FOXK1后，E-cadherin表达增加，且膜表达递增，Vimentin表达降低，有胞膜胞浆高表达降低为胞膜胞浆低表达;稳定表达株FOXK1-pcDNA3.1-SW480、 pcDNA3.1-SW480，瞬时转染的FOXK1-siRNA-SW480、Scr-siRNA-SW480四组细胞进行Western-blotting发现E-cadherin和γ-catenin的表达随FOXK1升高而降低，随FOXK1的表达降低而升高。
　　4、压低FOXK1可逆转rTGF-β1引起的EMT影响
　　4.1、rTGF-β1以时间依赖的方式诱导FOXK1和EMT相关蛋白的表达
　　rTGF-β1作用后0H、24H、48H观察，SW480和SW1116细胞中FOXK1表达量随作用时间的增加而递增，同时EMT相关蛋白的间质标识蛋白vimentin的表达亦出现递增，E-cadherin则随着rTGF-β1作用时间的增加而表达降低。
　　4.2、低表达FOXK1阻断rTGF-β1对FOXK1及EMT的诱导作用
　　对照组的SW1116细胞和SW480细胞在加入rTGF-β1后细胞变得细长，并伸出触角、伪足，而E-cadherin表达降低、Vimentin表达增加;Transwell试验中穿过基底膜的细胞也增加;但是通过转染FOXK1-siRNA后，纤长有触角、伪足的肠癌细胞再次变得短圆，而E-cadherin表达升高，vimentin的表达降低，侵袭试验中穿过基底膜的细胞数亦大大减少。以上数据均表明低表达FOXK1阻断rTGF-β1对FOXK1及EMT的诱导作用。
　　5、压低FOXK1表达对体内肿瘤侵袭转移作用的影响
　　5.1、慢病毒FOXK1-shRNA转染SW480细胞后FOXK1表达降低
　　Western blotting显示转染慢病毒FOXK1-shRNA的SW480细胞相对于对照组，FOXK1表达量明显下降。绿色荧光显示:在96小时，荧光强度和范围达到95％以上。
　　5.2、FOXK1可诱导裸鼠体内肿瘤转移及EMT过程
　　SW480/pEGFP-FOXK1和 SW480/pEGFP-N1(Vector)，或SW480/pEGFP-FOXK1 shRNA和SW480/pEGFP-src shRNA相比较，FOXK1高表达组的SW480引起的肿瘤更大。HE染色证实肝组织中存在转移的肠癌腺体细胞。免疫组织化学明确正常肝细胞中E-cadherin的表达较FOXK1高表达细胞所引起的肝脏转移癌组织的更高，qRT-PCR验证得到SW480/pEGFP-N1(Vector)较SW480/pEGFP-FOXK1组E-cadherin表达高，说明低表达FOXK1可以抑制肠癌细胞的转移能力，高表达FOXK1可以促进长癌细胞的转移能力，并且高表达FOXK1可促进转移癌中的EMT过程。
　　结论:
　　1、FOXK1在原发结直肠癌及淋巴结转移癌中均呈现高表达
　　2、低表达FOXK1抑制结直肠癌细胞EMT、迁移、侵袭
　　3、低表达FOXK1可逆转rTGF-β1诱导的结直肠癌细胞EMT、侵袭作用
　　4、动物实验证实低表达FOXK1可抑制结直肠癌细胞转移、EMT。

目录

摘要

第一章 FOXK1与结直肠肿瘤临床相关性的研究

1 引言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 总结

第二章 FOXK1与结直肠癌EMT、侵袭转移相关性研究

1 前言

2 实验材料

3 实验方法

4 结果

5 总结

全文总结

参考文献

中英文缩略词对照表

研究生期间发表的论文

致谢

声明