遗传性癫痫伴热性惊厥附加症家系SCN1A基因突变与药物疗效的相关性研究

摘要

目的：
　　通过了解钠通道的作用机制以及抗癫痫药物的治疗机制，根据个体发病机制选择合适的抗癫痫药治疗。探讨基因突变与临床药物疗效关系对疾病的精准治疗有重大的临床价值。
　　方法：
　　1.对象:收集2010年～2015年在广东省人民医院门诊及住院部确诊的GEFS+家系103个，选取200例健康人群为正常对照组，对照组无神经系统疾病的症状和体征，无相关疾病家族史。所有研究对象或其法定监护人均签署知情同意书，研究获得广东省人民医院伦理委员会批准。
　　2.临床资料:对家系成员进行详细的病史采集、体格检查，完善长程视频脑电图、头颅MRI等检查。建立详细资料库，包括年龄，性别，发作的相关资料（首次发作的年龄、发作的类型、首次发作是否与发热性疾病相关、随后的各种发作类型、频率），精神运动发育初步评估，神经系统症状和体征，脑电图和头颅影像学资料，服药情况，治疗效果，家族史，个人史、既往史等，并绘制家系图谱。家系受累成员发作类型根据ILAE2010年的癫痫发作和癫痫综合征分类标准进行诊断。
　　3.方法
　　(1)视频脑电监测:将病人安置于安静无干扰的单人病房，采用NICOLETONE脑电图扫描仪，按照10/20系统单、双极放置电极。进行各种诱发试验（睁闭眼、闪光刺激、睡眠诱发），实时监测24小时内各项活动、发作情况及脑电情况。每次记录均由两名专业医师判断结果。
　　(2)MRI扫描检查: MRI序列采用飞利浦MR扫描仪，Philip Achieva3.0T超导磁共振成像系统，所有患者行横断位快速自旋回波T2WI、T1WI以及横断位、冠状位、矢状位自旋回波T1WI增强检查。MRI结果均由两名专业医师判断结果。
　　(3)采集GEFS+家系及其成员300例和健康对照人群200例外周静脉血样5mL，EDTA抗凝，提取基因组DNA。
　　(4)应用目标序列捕获技术结合第二代测序技术对300例家系成员血标本进行癫痫相关基因检测。选取目标基因及探针设计，参考数据库OMIM以及HGMD，选取包括SCN1A基因在内的各类遗传性癫痫相关基因的共计485个，利用Agilent SureDesign在线设计工具，设计针对目标基因外显子及侧翼序列的靶向捕获探针;采用目标序列富集试剂盒对DNA样本制备目标基因捕获文库，实验过程包括超声破碎DNA片段、文库构建、杂交捕获、捕获文库扩增和纯化等，最后使用Agilent Bioanalyzer2100仪器对测序文库的DNA样本进行检测，按照捕获文库DNA样本浓度及测序深度要求，应用NEXTSEQ500测序仪进行测序;测序结果经评估分析后生成单核苷酸变异(singlenucleotide variation，SNV)报告。然后，运用PolyPhen-2.2.2软件、ANNOVAR软件、HGMD数据库、dbSNP数据库、1000 Genome数据库进行变异注释。最后，采用Sanger法对候选变异在200例健康对照者中进行验证。
　　(5)分析携带突变患者家系临床资料和基因测序结果，从而分析基因型与临床表型、基因型与抗癫痫药物治疗效果之间的关系。
　　结果：
　　1.在103个GEFS+家系中，发现11个家系共19人存在SCN1A基因杂合变异，包括9个错义突变（分别是R500Q、V1414A、M350L、L964R、V1362M、N275D、C142Y、S573R、C1274Y共9个位点），1个截断变异(K1083N fsTer13)，其中有2个家系共5人出现R500Q同一位点错义突变。
　　2.GEFS+家系SCN1A基因突变的临床特点:1）6个家系诊断为GEFS+，临床症状较轻，以FS/FS+为主，突变位点中V1414A、M350L、V1362M、C142Y、C1274Y为全面性发作，N275D为部分性发作;2）5个家系诊断为Dravet综合征，临床发作形式多样，其中R500Q、S573R、K1083NfsTer13先为部分性发作，后发展为全面性发作，L964R以全面性发作起病，后出现部分性发作。
　　3.GEFS+家系SCN1A基因突变与药物疗效的关系:1）V1414A错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅢS5-S6连接环处，N275D错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅠS5，C142T错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅠ跨膜片段S6，以上3个位点突变使用丙戊酸钠治疗有效，可控制临床发作;2）M350L错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅠS5-S6连接环处，V1362M错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅢS5，C1274Y错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅢS2，3个位点突变使用丙戊酸钠+左乙拉西坦治疗有效，可控制临床发作;3）R500Q错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅠ-Ⅱ连接环处，K1083NfsTer13截断突变位点位于钠通道α亚单位蛋白细胞内结构域DⅡ-DⅢ，S573R错义突变位点位于钠通道α亚单位蛋白结构域DⅠ-DⅡ连接环，以上3个位点突变可导致Dravet综合征，服用奥卡西平后症状加重，改用丙戊酸钠+左乙拉西坦治疗可减少临床发作;4）L964R错义突变位点位于钠离子通道α亚单位蛋白结构域DⅡ S5-S6连接环处，可导致Dravet综合征，服用奥卡西平后症状加重，改用丙戊酸钠+左乙拉西坦+托吡酯治疗可减少临床发作。
　　结论：
　　1.本研究新发现了1个SCN1A基因杂合错义突变(L964R)、1个截断变异(K1083N)，以上2个突变位点国内外未见报道。
　　2.SCN1A突变的GEFS+患者的抗癫痫药物疗效与基因突变的位置有关。1）V1414A、N275D、C142T这3个位点错义突变使用丙戊酸钠治疗有效，可控制临床发作;2）M350L、V1362M、C1274Y这3个位点错义突变使用丙戊酸钠+左乙拉西坦治疗有效，可控制临床发作;3）3个Dravet综合征患者分别存在R500Q错义突变、K1083NfsTer13截断突变、S573R错义突变，他们服用奥卡西平后均症状加重，改用丙戊酸钠+左乙拉西坦治疗可减少临床发作;另一个Dravet综合征患者存在L964R错义突变，服用奥卡西平后症状加重，丙戊酸钠+左乙拉西坦+托吡酯治疗可减少临床发作。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 遗传性癫痫伴热性惊厥附加症概念

1．2 GEFS+发病机制

1．3 钠离子通道结构

1．4 癫痫的基因检测及其临床效用

1．5 二代测序

1．6 目标序列捕获

1．7 研究的目的与意义

第二章 研究对象

2．1 实验组的纳入和排除标准

2．2 对照组的纳入和排除标准

第三章 试剂和仪器

3．1 主要使用试剂和耗材

3．2 主要仪器和设备

3．3 生物信息学获取途径

第四章 实验方法

4．1 视频脑电监测

4．2 MRI扫描检查

4．3 二代测序

4．4 应用Sanger测序验证

第五章 研究结果

5．1 GEFS+家系SCN1A基因突变临床表型分析

5．2 GEFS+家系SCN1A基因突变分析

5．3 GEFS+家系SCN1A基因突变临床药物疗效结果

第六章 讨论

6．1 GEFS+家系SCN1A基因突变的临床表型

6．2 GEFS+家系SCN1A基因突变特点

6．3 GEFS+家系SCN1A基因突变与药物疗效的关系

第七章 结论

第八章 创新点和不足

参考文献

英文缩略语

成果

致谢

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