对水稳定的两性羧酸金属有机骨架的合成及其疾病相关核酸的检测和MRI造影性能研究

摘要

金属有机骨架（Metal-Organic Frameworks，MOFs），也称为多孔配位聚合物，是一类由有机配体与无机金属离子构筑的新型晶态多孔材料。除了常规的化学性能，MOFs还具有比表面积大、孔洞形状和尺寸可调节等优点，能满足对不同物质进行可逆性吸附的要求。此外，由于MOFs的合成条件温和，大量功能性分子可以通过合理设计被纳入到材料中并赋予MOFs所需的潜在性能。基于MOFs的上述特点，在过去的25年中，大量的MOFs材料被合成出来并在催化，气体分离和储存，非线性光学与光捕获等方面得到广泛的应用。
　　近年来，MOFs在生物医药领域的研究如药物传递和生物成像等，受到了科研工作者的广泛关注。但是，大部分合成出来的MOFs都存在对水不稳定的缺陷，极大限制了该类材料的进一步研究。MOFs的水稳定性是该类材料在生物医药方面开展研究的前提，因此，设计合成对水稳定的MOFs对该类材料在生物医药领域的深入研究具有重要意义。
　　近几年来，我们关注的重点为季铵盐羧酸配体构筑的金属有机骨架及其生物活性研究。初步研究发现，该类型配体构筑的MOFs具有较高水的稳定性并能有效结合DNA。在此基础上，本文合成了四种新型的对水稳定的MOFs，并研究了该类型MOFs对疾病相关核酸的检测和磁共振(magnetic resonance imaging，MRI)造影性能。取得的主要结果简述如下:
　　一、在常温条件下，以N-羧甲基-(3，5-二羧基)溴化吡啶(H3CmdcpBr)为配体，构筑了基于Dy(Ⅲ)的MOF{[Dy(Cmdcp)(H2O)3](NO3)·2H2O}n(1)，产率为62％。化合物通过红外光谱、元素分析和X-射线单晶衍射等表征了结构。X-射线粉末衍射结果表明，化合物在水中浸泡一个月后其骨架结构并未发生明显的变化，提示化合物具有良好的水稳定性。实验结果显示，化合物1能与荧光标记的探针DNA(P-DNA)形成复合体系P-DNA@1并通过光诱导电子转移(PET)机制发生荧光淬灭现象，淬灭率为60±2％。进一步研究发现，P-DNA@1对Sudan病毒RNA保守片段T0具有较高的检测性能，荧光复苏率为0.65±0.03，检测限为0.16±0.01 nM，检测时间为120±3 min，并显示出高度的选择性。通过荧光各向异性实验和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验推测P-DNA@1对T0检测的作用机理可能为:化合物1首先通过静电、π-π堆积和（或）氢键作用与P-DNA结合形成P-DNA@1复合体系并产生荧光淬灭现象。在加入T0后，T0与P-DNA通过碱基互补配对的作用形成结构稳定的杂化双链DNA/RNA。由于杂化双链变大的横截面和螺旋骨架的保护作用，使得杂化双链与化合物1的相互作用减弱，并与化合物分离开来，体系的荧光也随着PET机制消失而复苏，实现了对T0的检测。通过分析化合物孔洞尺寸与P-DNA之间的相互作用，我们推测增大孔洞的尺寸有利于缩短复合体系对T0的检测时间。
　　二、为了缩短复合体系对T0的检测时间，我们设计合成了新型的长链柔性配体N-(3，5-二羧基苄基)-（4-羧基苯）溴化吡啶(H3DcbcbpBr)，并构筑了基于Cu(Ⅱ)的四核金属配合物[Cu4(Dcbcbp)4(H2O)12]·4H2O(2)。化合物通过红外光谱、元素分析和X-射线单晶衍射等表征了结构。为了探讨化合物孔径大小对RNA检测性能的影响，引入前期合成的六核金属配合物[Cu6(Cbdcp)6(H2O)18](3)(H3CbdcpBr=N-(4-羧基苄基)-（3，5-二羧基）-溴化吡啶）和双核金属配合物[Cu2(Dcbb)2(OH)2(H2O)6]·2H2O(4)（H2DcbbBr=1-(3，5-二羧基苄基)-溴化4，4'-联吡啶），三种化合物通过丰富的氢键形成三维孔洞结构。实验结果显示，基于化合物2，3和4形成的复合体系对T0具有快速检测的性能，检测时间分别为4.3±0.6，5.3±0.6和6.7±0.5 min，比P-DNA@1分别缩短了30倍，24倍和17倍，并显示出高度的选择性。荧光各向异性实验和聚丙烯酰胺凝胶电泳实验证明三种复合体系对T0检测可能的作用机制和P-DNA@1是相似的。
　　通过研究三种复合体系对不同长度target RNA的检测能力，考察了三种复合体系对Sudan病毒RNA检测性能的适用性。研究结果表明三种体系对长度为20-80个碱基的Sudan病毒RNA片段(T0-T80)具有检测能力，但这种检测能力随着target RNA的延长而减弱。根据上述实验结果，我们证明了基于化合物2-4的复合体系对短链RNA可能具有更好的检测效果。
　　三、为了进一步拓展化合物2-4在短链RNA检测方面的应用，我们以胃癌患者外周血中异常高表达的5种短链的miRNA(miR-185，miR-20a，miR-210，miR-25和miR-92b)为检测对象，考察了基于化合物2-4形成的复合体系对这5种miRNA的检测性能。实验结果显示，化合物2-4能与五种FAM标记的P-DNA形成复合体系并产生荧光淬灭现象。复合体系对目标miRNA都具有快速检测的能力，并显示出高度的选择性。进一步研究发现，基于化合物2的复合体系具有同时检测多种目标miRNA的能力。该研究结果提示此类MOFs可作为一种潜在的用于早期检测胃癌患者外周血miRNA的新型功能型材料，具有很高的研究价值。
　　四、为了进一步拓展两性羧酸MOFs在生物医药领域方面的研究，我们引入拥有较多未成对电子，并具有较大的磁矩、磁化率和较长的电子自旋弛豫时间的Mn2+和Gd3+离子，和H3CmdcpBr构筑了两种具有水稳定性的金属有机骨架{[Mn2(Cmdcp)2(H2O)2](H2O)}n(5)和{[Gd(Cmdcp)(H2O)3](NO3)·3H2O}n(6)，并研究了这两种化合物的MRI造影性能。实验结果显示，化合物5和6的纵向弛豫效能r1比商用造影剂Gd-DTPA分别提高了3倍和2.5倍，生物相容性好。进一步研究显示，化合物5能分布在肾脏中并改善肾脏成像的对比度和分辨率，造影持续时间比Gd-DTPA提高了1.6倍。该研究结果提示化合物5可作为一种潜在的MRI造影剂，在体内疾病特别是肾脏相关疾病的诊断中具有潜在的研究价值。
　　今后的工作中，在以两性羧酸金属有机骨架对疾病相关核酸检测和MRI造影的研究基础之上，拟通过在配体中引入羟基、胺基等功能性基团，在构筑水稳定性MOFs的基础上进一步改善MOFs孔洞的性质，赋予MOFs孔洞更丰富的功能，为具有水稳定性的功能型金属有机骨架的设计及其在生物医药领域的研究提供一定的参考价值。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 引言

1．2 金属有机骨架简介

1．2．1 金属有机骨架的构筑

1．2．2 金属有机骨架的特点

1．3 金属有机骨架的设计

1．3．1 等网格扩展

1．3．2 金属有机骨架的功能化

1．4 金属有机骨架在生物医药领域方面的应用

1．4．1 金属有机骨架在药物负载方面的研究

1．4．2 金属有机骨架在生物成像方面的研究

1．4．3 金属有机骨架在病毒DNA检测方面的研究

1．5 具有水稳定性的金属有机骨架设计

1．5．1 前合成配体修饰增加配体疏水性

1．5．2 后合成修饰提高骨架疏水性

1．5．3 疏水性涂层的应用提高骨架水稳定性

1．5．4 两性羧酸配体提高骨架水稳定性

1．6 研究内容及目的

参考文献

第二章 基于Dy(Ⅲ)的两性羧酸金属有机骨架的合成及其对Sudan病毒RNA保守片段的检测性能

2．1 引言

2．2 实验部分

2．2．1 实验试剂与实验仪器

2．2．2 {[Dy(Cmdcp)(H2O)3](NO3)·2H2O}n(1)的合成

2．2．3 化合物1的x-射线单晶衍射

2．2．4 Tris-HCl缓冲溶液的配制

2．2．5 TBE缓冲溶液的配制

2．2．6 聚丙烯酰胺凝胶配制

2．2．7 DNA／RNA溶液的配制及保存

2．2．8 化合物1结合P-DNA的荧光淬灭性能

2．2．9 P-DNA@1在T0存在时的荧光复苏能力

2．2．10 荧光各向异性测定

2．2．11 聚丙烯酰胺凝胶电泳

2．3 结果与讨论

2．3．1 {[Dy(Cmdcp)(H2O)3](NO3)·2H2O}n(1)的晶体结构

2．3．2 化合物1的水热稳定性

2．3．3 P-DNA@1对Sudan病毒RNA保守片段的检测性能

2．3．4 作用机理探讨

2．4 本章小结

参考文献

第三章 基于Cu(Ⅱ)的两性羧酸金属有机骨架的合成及其对Sudan病毒RNA保守片段的检测性能

3．1 引言

3．2 实验部分

3．2．1 实验试剂与实验仪器

3．2．2 配体H3DcbcbpBr的合成

3．2．3 [Cu4(Dcbcbp)4(H2O)12]·4H2O(2)的合成

3．2．4 化合物2的X-射线单晶衍射

3．2．5 基于化合物2-4与P-DNA的复合体系对Sudan病毒RNA保守片段的检测

3．3 结果与讨论

3．3．1 化合物2的结构表征

3．3．2 化合物2-4的水热稳定性

3．3．3 基于化合物2-4与P-DNA的复合体系对Sudan病毒RNA保守片段的检测性能

3．3．4 构效关系探讨

3．3．5 作用机理探讨

3．3．6 基于化合物2-4与P-DNA的复合体系对不同长度的Sudan病毒RNA的检测

3．4 本章小结

参考文献

第四章 基于Cu(Ⅱ)的两性羧酸金属有机骨架对胃癌患者外周血中micro RNA检测性能研究

4．1 引言

4．2 实验部分

4．2．1 实验试剂与实验仪器

4．2．2 基于化合物2-4与标记P-DNA的复合体系对miRNA的检测

4．2．3 基于化合物2与标记P-DNA的复合体系对多种miRNA的同时检测

4．3 结果与讨论

4．3．1 基于化合物2-4与FAM-P-DNA的复合体系对miRNA检测性能

4．3．2 作用机理探讨

4．3．3 基于化合物2与标记P-DNA的复合体系对多种miRNA的同时检测性能

4．4 本章小结

参考文献

第五章 基于Mn(Ⅱ)和Gd(Ⅲ)的两性羧酸金属有机骨架合成及其MRI造影性能研究

5．1 引言

5．2 实验部分

5．2．1 实验材料与实验仪器

5．2．2 {[Mn2(Cmdcp)2(H2O)2](H2O)}n(5)的合成与结构表征

5．2．3 {[Gd(Cmdcp)(H2O)3](NO3)·3H2O)n(6)的合成与结构表征

5．2．4 化合物5-6的X-射线单晶衍射

5．2．5 化合物5-6的体外MRI造影性能研究

5．2．6 化合物5-6的体外毒性研究

5．2．7 化合物5的体内MRI造影性能研究

5．2．8 化合物5的体内毒性研究

5．2．9 化合物5的生物分布

5．3 结果与讨论

5．3．1 化合物5-6的晶体结构解析

5．3．2 化合物5-6体外MRI造影性能及细胞毒性研究

5．3．3 化合物5体内MRI造影性能及毒性研究

5．4 本章小结

参考文献

全文总结

攻读学位期间发表的论文

附录

致谢

声明