联合检测初治急性髓系白血病患者MDR1、BAALC基因表达及MDR1基因在诱导化疗中的价值

摘要

目的:
　　1、构建实时荧光定量PCR检测MDR1和BAALC基因的方法;
　　2、检测初治AML患者中MDR1和BAALC基因的表达水平及不同FAB亚型患者中两基因表达水平的差异。
　　3、探讨AML患者在染色体核型、临床特征及免疫表型与MDR1和BAALCmRNA表达水平的关系;
　　4、分析MDR1和BAALC基因两者表达水平之间的关系及其与AML疗效和预后的关系。
　　5、明确IA与DA方案在AML患者诱导缓解中的作用及其与MDR1表达的关系。
　　方法:
　　1、培养KASUMI-1细胞，提取总RNA，以GAPDH为内参基因，针对MDR1和BAALC及GAPDH基因的mRNA设计引物，PCR扩增目标序列片段，PCR产物纯化后转化到T载体，构建含目标序列片段的质粒，做为阳性定量标准模板的克隆。
　　2、克隆的阳性定量标准模板按106，105，104，103，102，101 copies/μl进行梯度稀释，在荧光定量PCR仪分别进行PCR反应，得出标准曲线并验证该本实验方法的灵敏性和重复性，同时验证MDR1和BAALC、GAPDH三者扩增效率是否达到一致。
　　3、研究对象:经MICM(细胞形态学及组织化学染色、免疫分型、细胞遗传学以及分子生物学）确诊的209例初治AML患者以及30例非恶性血液病患者的骨髓标本。
　　4、收集AML患者骨髓标本，分离单个核细胞后提取总RNA，逆转录PCR方法逆转录为cDNA，进行Real Time PCR检测。每份标本均进行3次重复检测，每次进行3个复孔检测，经PCR仪器获得CT值并取其均数。为排除RNA浓度差异对扩增效率的影响，MDR1和BAALC mRNA表达水平采用相对表达量来表示，即采用2-△CT值(△CT=MDR1或BAALC-GAPDH;2-△CT=2GAPDH-MDR1或BAALC)来表示MDR1和BAALC的相对表达量;分析MDR1和BAALC表达水平与AML患者的性别、年龄、FAB分型、染色体核型、临床特征、疗效和预后之间的关系，并分析其临床意义。
　　5、209例AML患者中有189例分析选择了伊达比星（即去甲氧柔红霉素）联合阿糖胞苷或柔红霉素联合阿糖胞苷方案进行诱导缓解的患者。分析两种不同治疗方案中的治疗缓解率并分析其与MDR1表达之间的关系。诊断和疗效标准参照张之南主编的《血液病诊断与疗效标准》[67]。
　　6、统计学:利用SPSS19.0软件统计分析数据。两组计量资料间分布比较用Mann-whitney U test;两组以上计量资料间分布比较用Kruskal-wallis test及Bonferroni test;两变量间相关分析采用Spearman rank correlation test;率的比较采用卡方检验;生存分析采用Kaplan Meier analyses，不同生存曲线间差异采用log-rank test。生存时间的单因素和多因素分析使用Cox Regression。所有检验以P＜0.05为显著统计学差异，双侧检验。
　　结果:
　　1、利用Trizol提取的KASUMI-1细胞的总RNA，经甲醛变性琼脂糖凝胶电泳鉴定，可见28S和18S明显的2条条带，证明抽提的总RNA质量完好，无DNA污染。RT-PCR扩增后终产物经2％琼脂糖凝胶电泳，可看到与目的片段大小一致的62bp（MDR1）、60bp(BAALC)及225bp(GAPDH)的电泳条带。
　　2、不同浓度梯度标准品模板的对数值与荧光定量PCR扩增的循环数(CT值)之间有着非常好的线性相关关系(r=0.997，0.996，0.997)。本实验所构建的体系之灵敏度可达10拷贝/μl，重复性良好。MDR1和BAALC、GAPDH三者扩增曲线的斜率分别为-3.213、-3.208、-3.251;扩增效率分别为97％，96％，97％，说明三者扩增效率基本一致。
　　3、209例AML骨髓标本中MDR1基因表达量中位数为0.016(0～19.525)，BAALC基因表达量中位数为0.043(0～12.148);而30例非恶性血液病患者骨髓标本中MDR1基因表达量中位数为0.005(0～0.098)，BAALC基因表达量中位数为0.004(0.001～0.013)。AML患者组中MDR1基因及BAALC基因表达均显著高于正常对照组(P值均为0.000)。
　　4、AML患者中MDR1和BAALC基因表达水平与AML患者的年龄、性别、FAB分型、外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及染色体核型之间的异常均无统计学差异（P值均＞0.05）。
　　5、209例中有189例AML患者使用伊达比星或柔红霉素联合阿糖胞苷方案（标准3+7方案）进行诱导缓解治疗。其中有20例（MDS相关AML12例，老年白血病8例）选择其他方案进行化疗，包括含或不含有地西他滨的CAG方案。
　　6、209例患者中首次诱导化疗后CR率为72.2％(152/209)，而根据核型进行危险分层，92例中危AML中首次诱导化疗后CR率为79.3％(73/92)。中危AML中复发率为39.7％(29/73)。
　　根据MDR1和BAALC基因表达情况，将209例患者分为4组。MDR1基因和BAALC基因均高表达组、MDR1基因高表达而BAALC基因低表达组、MDR1基因低表达而BAALC基因高表达组、MDR1基因和BAALC基因均低表达组。后三组间病人的一般情况及预后资料之间无统计学差异，因此将后组合并为一个组，即MDR1和/或BAALC基因高表达组。中危组AML中低MDR1/低BAALC患者的CR率(93.3％ vs72.6％， P=0.021)和OS(50.3％ vs17.8％，P=0.001)明显高于MDR1和/或BAALC基因高表达组，而复发率明显低于MDR1和/或BAALC基因高表达组(7.1％ vs.42.5％, P=0.000)。与核型预后良好组AML相比，中危核型AML中低MDR1/低BAALC基因表达的患者的CR率(93.3％vs85.7％，P=0.341)、复发率(7.1％ vs.8.8％, P=0.514)以及OS(50.3％ vs63.1％,P=0.431)之间的差异无统计学异常。单因素分析结果提示，MDR1和/或BAALC基因高表达(P=0.019)与WBC(P=0.002)是OS的预后不良因素。
　　7、分析189例使用IA或DA方案进行诱导缓解化疗的AML患者的临床资料。结果提示189例初治AML患者获完全缓解的有130例，即CR率为68.8％;以MDR1表达水平的中位数为中界点，分为高MDR1表达组94例;低MDR1表达总例数为95例。其中IA方案诱导化疗组92例，而DA方案诱导组有97例。IA方案化疗后获CR者有76例，CR率为82.6％;而DA方案诱导组获CR者有54例，CR率为55.8％。IA方案组的CR率明显高于DA方案组(P=0.000)。而在高MDR1表达组中，其CR率为56/94(59.6％);而低MDR1表达组CR率为74/95(77.9％);高MDR1表达组CR率明显低于低MDR1表达组（P=0.007）。在不同细胞遗传学分层中比较发现，低危组及中危型AML患者中IA方案组的CR率显著高于DA方案组(低危组P=0.022;中危组P=0.008)，而高危组及未检测出核型AML患者中2组方案的CR率差异均无统计学意义(P均大于0.05)。进一步分析发现在预后良好和中危核型组间，高MDR1表达AML患者中IA方案治疗组的CR率明显高于DA方案治疗组（低危组P=0.037;中危组P=0.001），而在MDR1表达AML患者中IA和DA方案治疗组间的CR率无明显统计学差异（预后良好P=1;中危核型组P=0.082）。而在高危组及未检测出核型组间，不管MDR1表达高低，IA和DA方案治疗组间的CR率均无统计学差异（P值均大于0.05）
　　结论:
　　1、成功构建了荧光定量PCR检测MDR1和BAALC mRNA表达水平的方法。
　　2、AML患者MDR1和BAALC基因表达水平显著高于非恶性血液病患者，AML中MDR1基因表达水平与BAALC基因表达水平未存在相关性。
　　3、AML中MDR1、BAALC基因表达水平与AML的年龄、性别、FAB分型、外周血白细胞计数、骨髓原始细胞比例以及染色体核型之间的异常均无统计学差异(P＞0.05)。
　　4、联合检测MDR1和BAALC基因表达有助于提高成人AML中危核型组间治疗策略的调整。低MDR1/低BAALC的AML患者预后较好。
　　5、IA方案对初治AML患者诱导治疗的CR率优于DA方案，主要是通过提高低中危AML患者的CR率实现的;克服MDR1高表达对初治AML患者CR率的影响很可能也是IA方案诱导治疗CR率高于DA方案的重要因素。

目录

摘要

前言

第一章 荧光定量PCR方法检测AL中MDR1、BAALC基因表达水平的方法

1、材料与方法

2、结果

第二章 AML中MDR1、BAALC基因表达水平与AML临床特征、预后的关系

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

第三章 IA与DA方案治疗多药耐药高表达初治AML患者疗效和缓解质量的比较的研究

1、材料与方法

2、结果

3、讨论

全文小结

参考文献

在读学位期间成果

致谢

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