阿托伐他汀预处理对缺血再灌注心肌线粒体功能的保护机制研究

摘要

本文主要从以下几方面进行论述：
　　第1部分 缺血再灌注损伤动物模型的建立及单次负荷剂量阿托伐他汀钙预处理的保护作用
　　目的:
　　建立在体SD大鼠缺血再灌注模型，观察阿托伐他汀预处理对再灌注心肌的保护作用，观察氯尼达明对阿托伐他汀保护作用的影响。
　　方法:
　　1、缺血再灌注（Ischemia-reperfusion，I/R）动物模型制作:选择SD大鼠按照如下方法制作I/R模型:全麻下暴露心脏，离前降支起点约2-3 mm处用5-0丝线结扎前降支，阻断30分钟后松开再灌注120分钟。
　　2、动物分组:选择SD大鼠20只，随机分为4组，每组5只:(1)假手术组（sham组）:前降支只穿线，不结扎。(2)缺血再灌注损伤组（I/R组）:标准I/R动物模型操作。(3)阿托伐他汀预处理组(Ator组):I/R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃，然后进行I/R操作。(4)阿托伐他汀预处理+氯尼达明组（Ator+LND组）:I/R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃，I/R操作前12h用阿托伐他汀80 mg/kg灌胃，然后进行I/R操作，松开结扎线前10分钟经腹腔注射氯尼达明(50mg/kg)。
　　3、观察指标:记录实验动物的体重和左室重量，全程记录大鼠心率、心律变化。采用Evans Blue和TTC法检测缺血再灌注心肌缺血危险区和梗死区面积，用透射电镜观察再灌注心肌的超微结构的变化。
　　4、统计学方法:将数据用SPSS19.0统计软件进行统计学分析。计量资料采用(x)±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，先用Levene法进行方差齐性检验，若方差齐则采用LSD法行组间比较，若方差不齐采用Tamhane方法行组间比较。组间率的比较使用卡方检验。假设P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果:
　　1、基线资料比较:各组SD大鼠的体重分别Sham组244.08±8.81 g、I/R组243.92±10.41 g、Ator组246.69±8.23g、Ator+LND组247.62±8.14g，组间比较差异无显著统计学意义（P＞0.05）。缺血再灌注后各组左心室的重量分别为0.408±0.004g、0.405±0.008g、Ator:0.408±0.006g、Ator+LND:0.409±0.006g，各组间比较差异无显著统计学意义（P＞0.05）。
　　2、造模过程中的心律失常发生率:与Sham组相比，I/R组再灌注心律失常发生率显著升高(Sham vs I/R:7.7％ vs46.2％，P=0.027)，Ator组、Ator+LND组心律失常发生率升高，但未达统计学差异(Sham vs Ator:7.7％ vs23.1％，P=0.277; Sham vs Ator+LND:7.7％ vs38.5％,P=0.063)。Ator组(23.1％)、Ator+LND组(38.5％)再灌注后心律失常发生率低于I/R组(46.2％)，但未达统计学差异（P＞0.05）。
　　3、用缺血危险区面积/左室面积(area at risk/left ventricular，AAT/LV)表示心肌缺血面积比，用梗塞面积/缺血危险区面积(Infarct area/area atrisk，IA/AAR)表示梗死面积比。与I/R组相比，Ator组、Ator+LND组的AAR/LV显著减少，具有统计学差异。
　　4、透射电镜观察各组超微结构变化发现，I/R组胞质稀疏，分布不均，可见明显水肿。线粒体膜完整性破坏，局部有空泡，嵴断裂，排列紊乱，局部结构消失。Ator组线粒体表达丰富，结构相对完整，可见轻度水肿，嵴突数目略有减少、排列欠整齐，可见少许空泡、线粒体破裂现象。
　　结论:
　　1、在体大鼠I/R模型建立成功，在缺血再灌注建模前12h阿托伐他汀(80mg/kg)灌胃可以减少I/R损伤程度，氯尼达明部份抵消阿托伐他汀的心肌保护作用，
　　2、阿托伐他汀预处理可以减少I/R损伤性心律失常的发生率。
　　3、阿托伐他汀预处理可以减轻I/R心肌细胞线粒体超微结构损伤。
　　第2部分 阿托伐他汀钙预处理对大鼠缺血再灌注心肌UCP3表达和线粒体功能的影响
　　目的:
　　探讨阿托伐他汀预处理对I/R心肌UCP3表达的影响，观察阿托伐他汀对I/R心肌线粒体功能的保护作用，以及氯尼达明对UCP3和线粒体功能的影响。
　　方法:
　　选择SD大鼠32只，随机分为4组（sham组、I/R组、Ator组、Ator+LND组），每组8只，建立在体I/R模型（操作如第一部分）。在再灌注2h后，立即留取心脏标本，用RT-PCR法检测心肌UCP3基因转录水平，Western blot法检测心肌UCP3蛋白表达水平，检测心肌组织三磷酸腺苷(adenosine5' triphosphate，ATP)含量。留取血标本检测乳酸脱氢酶(lactatedehydrogenase，LDH)、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)、超氧化物歧化酶(SuperOxide Dismutase，SOD)、游离脂肪酸(Free fat acid，FFA)的含量。比较各组各个指标之间的区别。
　　使用Graphpad Prism及SPSS19.0统计软件进行统计分析，计量资料用(x)±s表示，多组间均数比较采用单因素方差分析，若方差齐应用LSD法进行组间比较，方差不齐则采用Tamhane方法进行组间比较，P＜0.05认为有统计学意义。
　　结果:
　　1、各组UCP3基因转录水平和蛋白含量的比较
　　与Sham组相比，I/R组、Ator组、Ator+LND组UCP3基因表达水平显著升高，差异有统计学意义(Sham vs I/R:1.02±0.17 vs1.42±0.21, P=0.003; Shamvs Ator:1.02±0.17 vs1.94±0.31, P＜0.001; Sham vs Ator+LND:1.02±0.17 vs1.70±0.28, P＜0.001); I/R组、Ator组、Ator+LND组UCP3蛋白含量显著升高，有统计学意义(Sham vs I/R:0.286±0.086 vs0.420±0.092, P=0.005; Sham vs Ator:0.286±0.086 vs0.584±0.099, P＜0.001; Sham vs Ator+LND:0.286±0.08 vs0.549±0.068, P＜0.001）。
　　2、各组LDH活性的比较
　　与Sham组相比，I/R组、Ator组、Ator+LND组LDH活性均显著升高，有统计学意义(Sham vs I/R:392.59±55.56 vs3864.15±162.92U/L, P＜0.001;Shamvs Ator:392.59±55.56 vs3056.17±136.22 U/L, P＜0.001; Sham vs Ator+LND:392.59±55.56 vs3578.01±239.41 U/L, P＜0.001)。
　　3、各组血浆SOD活力的比较
　　与Sham组相比，I/R组、Ator组、Ator+LND组SOD活力明显降低，具有统计学意义(Sham vs I/R:178.80±7.03 vs121.17±7.09 U/ml, P＜0.001; Sham vsAtor:178.80±7.03 vs159.53±8.64 U/ml, P＜0.001; Sham vsAtor+LND:178.80±7.03 vs143.27±6.15 U/ml, P＜0.001)。
　　4、各组血浆MDA组间比较
　　与Sham组相比，I/R组、Ator组、Ator+LND组MDA含量明显升高，具有统计学意义(Sham vs I/R:2.56±0.58 vs5.02±0.72nmol/ml, P＜0.001; Sham vsAtor:2.56±0.58 vs3.49±0.40nmol/ml, P=0.002; Sham vs Ator+LND:2.56±0.58vs4.45±0.47 nmol/ml, P＜0.001)。
　　结论:
　　1、缺血再灌注使UCP3基因转录水平和蛋白表达水平升高。阿托伐他汀预处理进一步上调了UCP3基因转录和蛋白表达水平。氯尼达明可部分抑制阿托伐他汀上调UCP3表达的作用。
　　2、阿托伐他汀预处理可以减轻心肌的I/R损伤，其机制可能与其减轻脂质过氧化损伤、增强心肌清除自由基的能力以及提高线粒体的ATP保有量有关;而氯尼达明可削弱阿托伐他汀的上述作用。
　　3、阿托伐他汀对UCP3的调节可能与血浆FFA的代谢无关。
　　总结:
　　缺血再灌注加重了心肌损伤，阿托伐他汀预处理对再灌注心肌有保护作用。氯尼达明减部抵消了阿托伐他汀的保护作用。阿托伐他汀可能通过上调UCP3的表达发挥再灌注心肌保护作用。血浆FFA的水平与UCP3的表达规律不一致，阿托伐他汀可能不是通过FFA调节UCP3的表达，其具体调节机制须进一步研究予以探讨。

目录

摘要

研究背景

参考文献

第一部分 缺血再灌注损伤动物模型的建立及单次负荷剂量阿托伐他汀预处理的保护作用

研究背景

实验材料与实验方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学处理

结果

1、实验动物基线资料比较

2、实验动物心电图变化

3、各组心肌缺血程度的变化

4、各组心肌梗死程度的变化

5、透视电镜观察心肌组织超微结构变化

讨论

结论

参考文献

第二部分 阿托伐他汀钙预处理对大鼠缺血再灌注心肌解偶联蛋白3表达的影响

研究背景

实验材料与实验方法

一、实验材料

二、实验方法

三、统计学处理

结果

1、UCP3基因表达水平的变化

2、UCP3蛋白表达水平的变化

3、各组LDH活性的变化

4、SOD的组间比较

5、血浆MDA的组间比较

6、心脏缺血再灌注后心肌内ATP含量的变化

7、各组血浆游离脂肪酸的组间比较

讨论

结论

参考文献

全文总结与展望

综述 UCP3在心脏缺血再灌注损伤中的研究进展

中英文缩略词表

攻读学位期间获得成果

致谢

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