Pluronic F127水凝胶负载脂肪干细胞对糖尿病性溃疡血管生成及愈合作用的研究

摘要

目的:糖尿病难愈性溃疡是糖尿病患者最严重、治疗费用最高的慢性并发症之一。相较于正常创面，糖尿病性溃疡往往迁延不愈，其最具特征性的变化是血管发生受损和肉芽组织形成障碍。目前临床及动物实验均显示干细胞疗法可以促进创面愈合，然而，干细胞移植到糖尿病难愈性创面面临着易被原位清除、移植效率低等难题。如何将干细胞递送到糖尿病伤口部位同时保持干细胞的高存活率是干细胞移植治疗糖尿病性溃疡的一个关键挑战。研究表明，采用新型智能水凝胶作为三维支架理化模拟细胞外基质，为干细胞移植到宿主创面提供合适的载体是这一问题一种有效的解决途径。Pluronic F127为聚氧乙烯聚丙乙烯三嵌段聚合物，其水凝胶溶液具有独特的温敏特性，在一定浓度和温度下可由液态转变为多孔三维结构的凝胶态。因其具有医用可注射性及良好的生物相容性，已被美国FDA批准用于人体。本实验以糖尿病大鼠为实验对象，选取Pluronic F127水凝胶负载脂肪源性干细胞创新性应于糖尿病创面复杂的修复环境，观察其对大鼠皮肤创面新生血管形成和愈合作用的影响。
　　方法:第1部分:胶原酶消化法分离培养健康SD大鼠ADSCs并流式鉴定细胞表型。建立SD大鼠1型糖尿病模型，MTT法比较糖尿病大鼠和正常大鼠ADSCs的增殖能力以选择合适的干细胞用于后续实验。第2部分，制备Pluronic F127水凝胶并测定凝胶化时间，CCK-8法检测不同浓度Pluronic F127对ADSCs增殖的影响，选择细胞亲和性最佳的凝胶浓度包裹ADSCs制备Pluronic F127-ADSCs复合物。在成模的24只糖尿病大鼠背部对称制作2个直径9mm的全层皮肤切口并随机分为ADSCs/Gel组、ADSCs组、Gel组、PBS对照组4组(n=6)。分别注射100ul相应溶液于创面。术后观察创面大体情况并评估各组创面愈合率，HE染色观察肉芽组织形成情况，CD31免疫组化染色观察新生血管情况，Ki67检测组织细胞增殖，qPCR检测VEGF、TGFβ-1的表达。
　　结果:成功分离纯化并流式鉴定ADSCs，MTT结果显示正常ADSCs较糖尿病来源ADSCs增殖能力更好。CCK-8结果显示20％的Pluronic F127相较于其他组更适宜细胞生长。动物伤口大体观和HE染色显示ADSCs/Gel组愈合较快且组织学评分较佳，在术后14天时愈合率为（97.8±1.8）％，明显高于其他组(P=0.000)。免疫组化结果示术后7天ADSCs/Gel、ADSCs组的血管数直观较Gel、对照组丰富，对术后14天进行微血管计数ADSCs/Gel组微脉管数目为(21.0±2.4)个，明显高于ADSCs组的（15.7±1.4）个(P=0.000)。qPCR结果也显示实验组VEGF、TGFβ-1水平在术后7、14天时出现了相应上调(P＜0.05)。免疫荧光结果示ADSCs/Gel组在术后7天时Ki67阳性表达率多于其他三组。
　　结论:局部移植同种异体ADSCs通过Pluronic F127水凝胶的包裹能提高细胞移植到糖尿病性溃疡创面的效率，从而优化了ADSCs促进糖尿病性溃疡血管生成和创面愈合的作用。

目录

摘要

前言

第一部分 大鼠ADSCs的分离培养及T1DM模型的建立

一、材料与仪器设备

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

第二部分 Pluronic F127负载ADSCs治疗糖尿病大鼠伤口的研究

一、材料与仪器设备

二、实验方法

三、实验结果

四、讨论

全文小结

参考文献

攻读学位期间成果

文献综述 干细胞治疗糖尿病足现状

致谢

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