丝素壳聚糖膜负载脂肪干细胞对糖尿病大鼠创面愈合影响的研究

摘要

随着糖尿病患者的增加，糖尿病慢性创面发生率也越来越高，其愈合主要与创面血管床条件欠佳和缺乏生长因子有关，目前尚没有比较完善而有效的治疗方法。组织工程是目前和未来应用于再生医学的重要治疗策略。因此，利用组织工程技术来解决这一问题已成为最佳选择。脂肪干细胞（ADSCs）容易获取，来源丰富，能够分泌多种生长因子，是理想的种子细胞；丝素和壳聚糖作为生物材料，均具有良好的生物相容性、无毒、低抗原性等优点，但也存在着各自的缺点，两者定量配比得到的复合材料丝素壳聚糖结合了两者的优点，又改善了两者的缺点，是理想的生物材料。本实验试图利用丝素壳聚糖（SF/CS）膜作为载体，将脂肪干细胞移植至创面，以促进创面愈合。 目的： 为探索一种有效治疗糖尿病慢性创面的方法，本实验制造了SD大鼠糖尿病模型，同时制备了丝素壳聚糖膜材料，并培养SD大鼠脂肪干细胞，使其贴附于丝素壳聚糖膜上，并将ADSC-SF/CS复合物移植于糖尿病大鼠背部创面，观察该复合物对糖尿病大鼠慢性创面愈合的影响，进而探讨该方式作为治疗糖尿病慢性创面方法的可行性。 方法： 1、通过胶原酶消化法从SD大鼠腹股沟脂肪中提取ADSCs，经流式细胞仪检测其表面标志物，并进行成脂、成骨、成软骨多向诱导； 2、制备丝素壳聚糖膜，用CM-Dil荧光染剂标记第3代大鼠脂肪干细胞，并移植于丝素壳聚糖膜上备用； 3、制造糖尿病大鼠模型：连续5天腹腔注射链脲佐菌素（STZ），观察大鼠的血糖变化； 4、取36只糖尿病大鼠，随机分为A、B、C组，于背部制作直径约1.5cm的圆形创面，A组创面为空白对照组，B组创面移植SF/CS材料，C组创面移植ADSC-SF/CS复合物。在第3、7、14、21天收集创面标本用于后续实验；测量创面面积，计算创面愈合率。 5、采用苏木素-伊红染色，观察ADSC-SF/CS复合物对创面愈合过程中肉芽组织成熟度及面积、上皮爬行等的影响； 6、组织免疫荧光染色，分别用CD31、α-SMA、K10抗体标记血管内皮细胞、平滑肌细胞、表皮细胞，并观察免疫荧光染色与CM-Dil染色是否有重叠； 7、ELISA检测创面组织内EGF、TGF-β、VEGF的水平，观察脂肪干细胞分泌功能对创面愈合的影响。 结果： 1、经过胶原酶消化法可方便、有效地提取出ADSCs，经流式鉴定显示CD90、CD29为（+），CD45为（-），并可成功多向诱导； 2、丝素壳聚糖膜为单面磨砂的膜状材料；用CM-Dil标记的脂肪干细胞可牢固贴附于丝素壳聚糖材料上； 3、STZ腹腔注射SD大鼠后，血糖持续≥16.7mmol/L，同时出现多饮、多食、多尿、体重下降等症状。维持糖尿病状态8周后，糖尿病大鼠皮肤及皮下组织变薄，弹性变差，皮肤血供减少。 4、第14天时，ADSC-SF/CS组创面愈合率较SF/CS组和空白对照组明显升高 （P<0.01），上皮爬行距离、创面裂隙、肉芽组织面积测量值与SF/CS组和空白对照组存在差异（P<0.01），HE染色观察并比较各组各个时间点肉芽组织成熟度，可见ADSC-SF/CS组肉芽组织成熟度明显较其余两组发展快； 5、第14天时，ELISA检测创面EGF、TGF-β、VEGF浓度结果示ADSC-SF/CS组明显高于SF/CS组和空白对照组（P<0.05）；免疫荧光结果示CM-Dil标记的ADSCs与CD31标记的血管内皮细胞、α-SMA标记的平滑肌细胞、K10标记的表皮细胞均有共显像部分。 结论： 1.丝素壳聚糖膜表面为磨砂样结构，脂肪干细胞能够在其上良好附着； 2.脂肪干细胞以丝素壳聚糖为载体成功移植于创面，并发挥其分泌及分化功能； 3.以丝素壳聚糖膜为载体将脂肪干细胞移植至创面以促进创面愈合的方法是可行、有效的。

目录

声明

第一部分前言

第二部分材料与方法

2.1 主要试剂

2.2 主要仪器

2.3 脂肪干细胞的提取与培养

2.4 脂肪干细胞鉴定

2.5 丝素壳聚糖膜的制备及扫描电子显微镜观察

2.6 脂肪干细胞-丝素壳聚糖膜复合物的制备

2.7 糖尿病大鼠造模以及背部创面造模

2.8 计算创面愈合率

2.9 创面组织HE染色及分析

2.10 免疫荧光

2.11 ELISA测试创面组织中EGF, TGF-β1,VEGF含量

2.12 统计学分析

第三部分

3.1 脂肪干细胞的特性

3.2 丝素壳聚糖膜的肉眼观察及电镜下观察

3.3 CM-Dil染色的ADSCs贴附于丝素壳聚糖膜的镜下观察

3.4 糖尿病大鼠造模及创面观察

3.5 H.E染色结果分析

3.6 免疫荧光染色结果

3.7 创面组织ELISA检测结果及比较

第四部分讨论

1. 糖尿病创面难愈性现状

2. 组织工程在创面治疗中的应用

3. 脂肪干细胞鉴定：形态、多向分化、表面标志物

4. 脂肪干细胞贴附于丝素壳聚糖膜

5.脂肪干细胞促进创面愈合的作用机制

6. 总结

五、结论

参考文献

七、中英文词汇对照

八、发表论文

九、参加会议

十、参与研究

致谢

特别鸣谢