精索静脉曲张不育患者精浆外泌体蛋白质组学的初步研究

摘要

目的:
　　精索静脉曲张已成为男性不育的主要原因之一，但其致男性不育的机制尚未阐明。建立正常人精浆外泌体蛋白谱为研究精索静脉曲张不育患者精浆外泌体比较蛋白组学研究提供参考，初步描绘精浆外泌体相关蛋白在精索静脉曲张致男性不育的潜在分子功能作用，发现潜在的精浆外泌体生物标志物，并进一步构建精索静脉曲张大鼠模型以期为研究精索静脉曲张精浆外泌体差异蛋白致男性不育的相关分子机制奠定基础。
　　方法:
　　1.在南方医院检验中心收集正常志愿者精液标本18例，分别对12例精液标本采用超高速差速离心和6例精液标本采用PEG6000富集方法提取精浆外泌体，免疫印迹验证外泌体蛋白标志物，纳米颗粒跟踪分析仪(NTA)分析其粒径大小，透射电镜(TEM)观察其形态;
　　2.对12例超高速差速离心提取的精浆外泌体后进行精浆外泌体蛋白质谱分析，并用免疫印迹方法验证其鉴定蛋白的可靠性;
　　3.另外选取6例精索静脉曲张不育患者和6例正常生育志愿者精液样本为研究对象，基于TMT定量蛋白质组学技术分析其精浆外泌体差异蛋白表达谱，生物信息学基因本体(GO)分析差异蛋白的细胞定位，生物学过程，分子功能;
　　4.采用左侧肾静脉半缩窄法结合完全结扎精索静脉各属支构建精索静脉曲张大鼠模型，与传统方法对比，探讨银夹新方法的可行性。
　　结果:
　　1.采用超高速差速离心和PEG6000富集方法的提取物均阳性表达外泌体标志蛋白CD63，ALIX，TSG101等，TEM结果显示其呈类圆形、椭圆形囊泡形态，内含电子致密物，NTA分析显示其粒径大小均在30-150nm;
　　2.正常人精浆外泌体蛋白谱总共鉴定了1474个蛋白，生理状态下这些蛋白主要参与蛋白代谢、能量途径、蛋白代谢、细胞生长/维持和转运等生物学过程，并选取其中PHGDH，LGALS3BP，SEMG1，ACTB，ALIX，GAPDH蛋白验证其可靠性，结果与质谱数据相一致;
　　3.精索静脉曲张精浆外泌体差异蛋白表达谱总共鉴定了1457个蛋白，其中定量蛋白数为1331个。与正常生育组相比，发现了精索静脉曲张不育患者精浆外泌体差异蛋白175个，其中上调76个蛋白，下调99个蛋白。GO分析表明这些差异蛋白主要参与的“细胞生长/维持”、“能量途径”、“代谢”、“转运”等生物学过程失调，这与精索静脉曲张致男性不育密切相关;
　　4.与假手术组相比，传统组和银夹组在手术8周后，其左侧精索静脉直径均大于1mm，左侧肾脏未见病理学改变，显示模型成功。其中，传统组中出现左肾静脉撕破出血及左肾积水等并发症导致造模失败3只，银夹组银夹滑脱1只，传统组和银夹组造模成功率分别为75％和87.5％。
　　结论:
　　1.PEG6000富集方法可作为提取和鉴定精浆外泌体的有效方法;
　　2.建立了正常人精浆外泌体蛋白表达谱，为男性生殖系统疾病等比较蛋白组学研究提供了参考基础;
　　3.初步描绘了精索静脉曲张不育患者精浆外泌体蛋白表达谱，其差异蛋白主要表现为“细胞生长/维持”、“能量途径”、“代谢”、“转运”等生物学过程失调，这可能在精索静脉曲张致男性不育中发挥着重要作用，这些差异蛋白也可作为精索静脉曲张不育患者的潜在生物标志物;
　　4.银夹新方法可简便、安全复制精索静脉曲张大鼠动物模型，为后续研究精浆外泌体蛋白在精索静脉曲张致男性不育的相关机制奠定了基础。

目录

摘要

前言

第一章 精浆外泌体的分离、提取及鉴定

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 基本资料

2．2 基于超高速差速离心结合蔗糖垫提取精浆外泌体的鉴定

2．3 基于PEG6000富集提取精浆外泌体的鉴定

3 讨论

第二章 正常人精浆外泌体蛋白表达谱的建立

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 正常人精浆外泌体蛋白谱的综合分析

2．2 与胞外囊泡及外泌体公共数据库及已发表的精浆蛋白谱对比分析

3 讨论

第三章 精索静脉曲张不育患者精浆外泌体蛋白表达谱的分析

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 临床样本的资料

2．2 定量蛋白组学质量控制结果分析

2．3 精索静脉曲张不育患者精浆外泌体与正常体检者精浆外泌体定量差异蛋白组学研究结果

2．4 显著差异表达蛋白质的生物信息学分析

3 讨论

第四章 银夹新方法构建精索静脉曲张大鼠模型研究

1 材料与方法

1．1 材料

1．2 方法

2 结果

2．1 精索静脉曲张大鼠模型的成功建立及其各组的一般情况

2．2 精索静脉曲张大鼠模型的评估

3 讨论

全文小结

研究不足之处

参考文献

英文缩写注解

攻读学位期间成果

致谢

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