胰高血糖素样肽-1对抗HUVEC细胞氧化损伤并抑制PANC-1细胞迁移

摘要

糖尿病是一种以高血糖为特征的代谢性疾病，控制不良会引起许多并发症，其中血管并发症是糖尿病患者死亡的主要原因。内皮细胞损伤是糖尿病血管损伤过程中最早出现的病理现象。在糖尿病状态下，长期的高血糖血症刺激，诱导发生氧化应激，造成血管内皮细胞损伤。
　　当机体受到有害刺激时，体内氧化与抗氧化系统失衡，从而引起组织细胞发生氧化损伤。研究发现，在糖尿病状态下，内皮细胞ROS生成增多，导致发生氧化应激，从而引起糖尿病心血管损伤。机体内抗氧化应激的酶也有很多，如过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)和超氧化物歧化酶(SOD)。它们构成抗氧化系统，维持氧化与抗氧化的动态平衡。
　　GLP-1作为一种治疗糖尿病的新型药物，不仅可以降低血糖，还可以抑制氧化应激引起的血管内皮细胞损伤，但其抗氧化应激损伤的机制尚未阐明。另外，GLP-1可直接促进细胞增殖，提高细胞生存，例如胰岛β细胞、神经细胞、纤维母细胞和心肌细胞。那么，GLP-1对肿瘤细胞是否也存在类似的促增殖作用？GLP-1长期用药是否存在致癌风险？目前还未有定论。再有，氧化应激被证实可诱导肿瘤细胞发生上皮间质转化(EMT)，GLP-1的抗氧化应激作用是否会对肿瘤细胞的EMT转化产生影响，目前尚未见报道。
　　目的:
　　1、探讨胰高血糖素样肽-1（GLP-1）对过氧化氢(H2O2)诱导的内皮细胞氧化损伤的保护作用及机制。
　　2、探讨胰高血糖素样肽-1(GLP-1)对PANC-1细胞增殖和EMT的影响。
　　方法:
　　1、取人脐静脉内皮细胞(HUVECs)，分为正常对照组、H2O2组、GLP-1组、H2O2+10nmol/L GLP-1组、H2O2+100nmol/L GLP-1组、H2O2+1000nmol/L GLP-1组。采用荧光显微镜检测细胞内活性氧自由基(ROS)水平、观察细胞骨架F-actin变化和过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)蛋白表达;采用流式细胞仪检测细胞凋亡比率;Western Blotting检测磷酸化的雷帕霉素靶蛋白(p-mTOR)、过氧化氢酶(CAT)、谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)蛋白水平;实时荧光定量聚合酶链锁反应(QPCR)检测抗氧化酶:过氧化氢酶(CAT)、超氧化物歧化酶2(SOD2)和谷胱甘肽过氧化物酶1(GPX1)基因的表达变化。
　　2、CCK8试剂盒检测胰腺癌细胞(PANC-1)增殖;细胞划痕实验和transwell实验检测PANC-1细胞的迁移。实时荧光定量聚合酶链锁反应(QPCR)检测上皮间质转化(EMT)相关基因E-钙黏素(E-cadherin)和N-钙黏素(N-cadherin)的表达变化。
　　结果:
　　1、H2O2组HUVEC细胞骨架破坏明显，细胞内ROS含量增加，细胞凋亡率增加;加入GLP-1后，细胞骨架破坏受到显著抑制，ROS含量减少，凋亡率降低。Western Blotting结果显示，H2O2组p-mTOR表达降低，GLP-1可以提高p-mTOR表达，使蛋白水平趋于正常;加入GLP-1受体拮抗剂艾塞纳肽(9-36)后，GLP-1不能上调p-mTOR表达。H2O2作用后，CAT、SOD2和GPX1基因表达降低，CAT和GPX1蛋白表达量也降低，而GLP-1可以逆转这些抗氧化酶表达的降低。
　　2、不同浓度的GLP-1对PANC-1细胞增殖率没有影响，但是可以抑制PANC-1细胞迁移。H2O2作用于PANC-1细胞后，E-cadherin基因表达下调，N-cadherin基因表达上调，GLP-1可逆转E-cadherin基因表达下降和N-cadherin基因表达升高。
　　结论:
　　1、GLP-1可能通过增加p-mTOR蛋白表达，活化mTOR通路起保护作用;GLP-1通过上调CAT、SOD2和GPX1表达，抑制ROS产生，保护内皮细胞对抗氧化应激损伤。
　　2、GLP-1对PANC-1细胞增殖没有影响，但是可以抑制PANC-1细胞迁移。
　　3、GLP-1抑制H2O2诱导胰腺癌PANC-1细胞的EMT。

目录

摘要

前言

第一章 胰高血糖素样肽-1改善过氧化氢诱导血管内皮氧化损伤的研究

1．1 实验材料

1．1．1 实验细胞

1．1．2 主要实验试剂

1．1．3 主要实验器材

1．1．4 主要试剂的配置

1．2 实验方法

1．2．1 细胞培养

1．2．2 细胞消化传代

1．2．3 细胞冻存

1．2．4 细胞骨架F-actin染色分析

1．2．5 细胞内活性氧簇(ROS)水平检测

1．2．6 流式细胞术检测细胞凋亡

1．2．7 Western blot分析

1．2．8 实时定量PCR

1．2．9 免疫荧光

1．2．10 统计学分析

1．3 实验结果

1．3．2 GLP-1抑制氧化应激下ROS的产生

1．3．3 GLP-1抑制H2O2诱导的HUVEC细胞凋亡

1．3．4 GLP-1逆转H2O2诱导的mTOR活性抑制

1．3．6 GLP-1促进抗氧化蛋白CAT、GPX1的表达

1．4 讨论

1．5 小结

第二章 胰高血糖素样肽-1抑制PANC-1细胞的迁移

2．1、实验材料

2．1．1 实验细胞

2．1．2 主要实验试剂

2．1．3 主要实验器材

2．1．4 主要试剂的配置

2．2 实验方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞消化传代

2．2．3 细胞冻存

2．2．4 PANC-1细胞铺板

2．2．5 CCK8实验

2．2．6 细胞划痕实验

2．2．7 Transwell迁移实验

2．2．8 Giemsa染色

2．2．9 Hoechst染色

2．2．10 实时定量PCR

2．2．11 统计学分析

2．3 实验结果

2．3．2 GLP-1抑制胰腺癌PANC-1细胞的迁移

2．3．3 GLP-1促进E-cadherin基因表达，抑制N-cadherin基因表达

2．4 讨论

2．5 小结

参考文献

中英文缩略词表

攻读硕士期间成果

致谢

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