TCF12低水平表达有助于预测前列腺癌患者的进展和生化复发

摘要

研究背景及目的:
　　前列腺癌(PCA)是男性最常见的恶性肿瘤，在全世界癌症死亡原因排第二位，特别是在西方国家[1]。虽然前列腺癌的早期诊断和预防取得了很大进展，但发病率和死亡率仍在不断增加。患者被诊断为前列腺癌时多为晚期，其特征在于癌细胞可能会从前列腺内向远处转移[2]。不同的临床病理特征，如血清前列腺特异性抗原(PSA)、肿瘤淋巴结转移(TNM)阶段和Gleason评分，已被广泛地用于将前列腺癌患者分为不同的危险组[3]。然而，这些参数都有局限性，不能作为唯一的标准[4]。因此，有必要寻找更准确的生物标志物来预测前列腺癌的诊断和预后。
　　转录因子12（TCF12，也称为HEB或HTF4），为螺旋-环-螺旋(HLH)蛋白家族的一员，具有DNA结合能力(E-box)[5]。TCF12蛋白被发现在许多组织中广泛表达，可以形成同源或异源二聚体[6]。在功能上，TCF12负责细胞的发育和分化[7]。据报道，TCF12可以调节淋巴细胞、神经细胞的分化或间充质的发育[8];基因突变的基因与其它分子片段的易位融合可导致颅缝早闭或间质肿瘤[9]。越来越多的证据表明，TCF12功能在多种人类肿瘤可能是癌基因或抑癌基因。例如，He等[10]发现，胆囊癌患者组织中TCF12表达升高与较差的总生存期相关;Tang等[11]表明，肿瘤相关成纤维细胞中TCF12明显升高，导致细胞外基质重塑和引发乳腺癌细胞在体外和体内的侵袭和转移;Lee等[12]确定TCF12可能作为一个转录抑制E-cadherin的表达与结直肠癌的发生密切相关;与此相反，Chen等人[13]确定TCF12为口腔鳞状细胞癌中mir-211的直接靶标，并证实它的功能为抑制这种恶性肿瘤的致癌性。然而，TCF12在前列腺癌中的表达情况和分子生物学功能尚不清楚。
　　近来，小分子RNA(microRNAs，miRNAs)在各种肿瘤中的作用受到越来越多的关注。miRNAs调控了人类超过一半的编码蛋白的基因，它们的功能紊乱或表达水平异常与肿瘤的发生和进展密切相关。目前，许多研究表明miRNAs在前列腺癌中扮演重要的角色，如miR-30d、miR-373和miR-520c。所以，miRNAs是研究前列腺癌分子机制的重要组成部分及潜在治疗靶点。miR-30d已被证实在多种恶性肿瘤中表达上调，并发挥关键的促癌作用，包括黑色素瘤、肝细胞癌、肺癌和周围神经鞘瘤。证实了miR-30d可通过直接调控靶标基因的表达从而参与调控肿瘤细胞的生物学功能过程，例如细胞周期、细胞凋亡、细胞迁移、细胞侵袭和血管生长等，参与肿瘤的发生和发展，并最终影响肿瘤的转归和预后。一般认为，miRNAs的生物学功能具有高度的组织和细胞特异性，miR-30d也不例外。既往的研究和我们先前的实验已经证实了miR-30d在前列腺癌中表达上调，并发挥关键的促癌作用。因此，我们利用基因表达谱芯片技术对过表达miR-30d和NC对照的LNCaP和DU145细胞株进行基因表达谱分析，获得一批miR-30d调控的差异表达下调的基因，使用软件预测网络系统在表达下调基因中筛选与转录有关的基因，并鉴定了TCF12作为候选基因。
　　作为螺旋-环-螺旋蛋白家族的一个成员，TCF12在多种人类肿瘤作为一个癌基因或抑癌基因[13]。然而，TCF12是否参与前列癌目前并没有任何报道。我们首先采用免疫组化法鉴定前列腺癌和良性前列腺增生组织标本中TCF12蛋白的表达。探讨TCF12与前列腺癌的临床相关性，探讨TCF12在前列腺癌中的作用，然后对TCF12的表达与各种临床病理特征和预后的关系进行评估分析。此外，分别通过体外和体内实验确定它在肿瘤细胞的增殖，迁移，侵袭和肿瘤生长的作用。
　　材料:
　　1.人临床组织来源:50例人的前列腺癌组织芯片(Tissue microarrays，TMA)购自西安艾利林生物科技有限公司(西安，中华人民共和国;目录号:PR807a)。排除手术前已行化疗或放疗的患者。为了评估TCF12与前列腺癌的临床相关性，我们使用Taylor数据库，它是一个公用的数据平台，其中miRNA表达谱芯片包含带有临床随访数据的150个原发性前列腺癌组织和29例癌旁良性前列腺组织[14];其中前列腺癌组织miRNA表达谱芯片包含有详细临床随访数据的113个原发性前列腺癌病例。
　　2.动物:BLAB/c裸鼠8只，雄性，4-6周龄，购于中山大学实验动物中心。
　　3.细胞株:两种人前列腺癌细胞株（DU145和LNCaP）是2012年从美国马纳萨斯(Manassas，VA，USA)的American Type Culture Collection(ATCC)公司购买获得。
　　方法:
　　1.构建miR-30d、TCF12抑制表达和过表达质粒(Danvers，MA，USA)，并用TransDux病毒转染试剂(型号:LV850A-1，SBI，USA)将其转染到DU145和LNCaP细胞株中。
　　2.利用基因表达谱芯片技术对过表达miR-30d和NC对照的LNCaP和DU145细胞株进行基因表达谱分析，获得一批miR-30d调控的差异表达下调的基因。使用软件预测网络系统在表达下调基因中筛选与转录有关的基因。
　　3.通过蛋白质印迹法检测转染后miR-30d、TCF12抑制表达和过表达在DU145和LNCaP细胞株中的表达情况，并验证抑制表达和过表达miR-30d的LNCaP和DU145细胞株中miR-30d和TCF12之间的表达相关性。
　　4.利用统计学方法，分析Taylor临床前列腺癌组织miRNA芯片数据库中TCF12表达水平与前列腺癌患者的临床特征以及预后的相关性，如PSA水平、Gleason评分、是否生化复发等。通过生存曲线分析及Cox回归分析，分别研究TCF12的表达与总体生存率、无生化复发生存率的关系及其它指标对前列腺癌总体生存及无生化复发生存的影响，是否可以作为预后的预测因子。
　　5.细胞功能实验分析TCF12基因表达上调或下调对前列腺癌细胞的增殖、迁移、侵袭等功能的影响，包括细胞增殖实验、凋亡实验、划痕实验、侵袭实验等。裸鼠皮下接种过表达DU145细胞株形成裸鼠皮下移植瘤模型，用于分析TCF12在体内对前列腺癌成瘤的影响。
　　统计学处理:
　　数据统计分析用SPSS19.0统计软件包处理。连续变量以(X)±s的形式展示。计数资料采用Pearson卡方检验。qRT-PCR、免疫组化、Western blot和细胞功能实验等定量结果的统计学分析采用两独立样本t检验。重复测量方差分析进行不同时间点上两组数据之间的比较。LSD法用于两个以上分组的组间两两比较。Taylor临床前列腺癌组织芯片数据库中TCF12基因表达水平和前列腺癌患者的临床特征之间的关系通过两个独立样本t检验和One-way ANOVA检验进行统计。通过Kaplan-Meier方法及log-rank检验进行前列腺癌患者临床生存分析。COX风险回归模型单因素和多因素分析评估TCF12是否能作为预测前列腺癌预后的独立指标。P＜0.05为差异具有统计学意义。
　　结果:
　　1.在过表达miR-30d的基因表达谱分析中，我们获得25个表达下调的基因，其中包括TCF12。此外，我们进行蛋白质印迹法分析，结果显示与空白载体对照组相比，TCF12和miR-30d在蛋白质表达水平中存在负相关。
　　2.组织芯片免疫染色分析显示前列腺癌组织标本的TCF12低表达与高Gleason评分显著相关(P=0.009)。由于前列腺癌组织标本（TMA数据）不包括更多的临床病理特征，如术前PSA水平，总生存，生化复发，转移和病理分期等，我们使用前列腺癌临床芯片数据集（Taylor公用数据库）来分析TCF12表达水平与临床特征之间的关联和前列腺癌患者的预后，结果显示TCF12的下调表达与Gleason评分、术后发生转移和生化复发呈负相关，有统计学意义(P分别为0.025，0.001和0.019)，而TCF12表达水平与年龄、术前PSA水平、是否死亡和病理分期之间不存在统计学意义的相关性。
　　3.Kaplan-Meier法和Log rank法分析评价TCF12表达在前列腺癌预后中的价值，结果显示低表达TCF12与前列腺癌患者的预后不良有关，高表达和低表达TCF12的前列腺癌患者的总体生存率没有显著差别(P=0.737)，而TCF12高表达组的患者其生化复发率低于TCF12低表达组的患者(P=0.004)，说明TCF12低表达可能是生化复发的一个危险因素。COX回归模型单因素和多因素分析结果提示，TCF12基因表达水平[P=0.046]、Gleason评分[P＜0.001]和病理分期P=0.012]是前列腺癌根治术后生化复发风险的独立预测因子。
　　4.成功构建TCF12过表达和抑制表达的DU145和LNCaP细胞株，通过蛋白质印迹检测TCF12蛋白的表达，结果显示TCF12过表达的蛋白水平显着高于NC组(P＜0.05)，而TCF12下调表达的蛋白水平显著低于NC组(P＜0.05)，说明转染转染效果良好。体外细胞功能实验显示TCF12过表达的DU145和LNCaP细胞株的迁移、增殖和侵袭能力相对空白对照组明显减弱(P＜0.05)。相反，TCF12抑制表达的DU145和LNCaP细胞株的迁移、增殖和侵袭能力相对对照组明显增强(P＜0.05)。
　　5.裸鼠皮下移植瘤模型显示TCF12过表达能够显著性抑制由DU145形成的移植瘤的成瘤大小和生长速度(P＜0.05)，证实过表达TCF12抑制肿瘤细胞的侵袭和增殖。
　　结论:
　　1.TCF12在前列腺癌中是一个重要的抑癌基因，抑制前列腺癌进展，并作为独立预测指标预测前列腺根治性切除后生化复发和转移的风险。
　　2.前列腺癌组织标本的TCF12低表达与高Gleason评分显著相关，有望通过检测前列腺癌组织中TCF12的表达水平，协助传统的临床病理指标更准确地区分低度恶性和高度恶性的前列腺癌，优化治疗方案。

目录

摘要

第1章 前言

1．1 前列腺癌的流行病学

1．2 前列腺癌的诊断

1．3 前列腺癌的治疗

1．4 前列腺癌细胞基因调控

1．5 miRNA与转移调控

1．6 miRNAs与前列腺癌

1．7 miR-30d的研究进展

1．8 转录因子

1．9 转录因子12(TCF12)的表达与功能

1．10 本研究拟解决的问题

3．探索TCF12在人类前列腺癌中的生物学功能

第2章 材料与方法

2．1 材料

2．1．1 组织来源及临床资料

2．1．2 标本采集

2．1．2 实验动物

2．1．3 细胞株

2．1．4 实验主要试剂

2．1．5 实验主要仪器

2．2 方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 质粒构建

2．2．3 细胞转染

2．2．4 建立裸鼠移植瘤模型

2．2．5 荧光实时定量PCR(qRT-PCR)

2．2．6 免疫组织化学染色

2．2．7 蛋白质印迹法(Western blot)

2．2．8 细胞功能实验

2．2．9 统计学处理

第3章 结果

3．3 前列腺癌组织标本的TCF12低表达与高Gleason评分显著相关

3．4 TGF12的表达水平与前列腺癌患者的临床病理特征的相关性

3．5 TCF12的mRNA表达水平降低提示前列腺癌预后差

3．6 TCF12可作为判断前列腺癌预后的独立指标

3．7 TCF12在体外能够抑制前列腺癌细胞增殖、迁移和侵袭，以及诱导细胞凋亡

3．8 TCF12在体内能够抑制肿瘤生长、侵袭

第4章 讨论

4．1 TCF12在前列腺癌中的表达下调

4．2 TCF12表达水平与前列腺癌的恶性程度和预后负相关

4．3 TCF12在前列腺癌中的分子生物学功能

结论

本研究的不足之处

参考文献

攻读博士学位期间的成果

致谢

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