AF9在高效蛋白质转导技术重编程BM-MSCs为心脏祖细胞中的作用

摘要

目的：心血管系统疾病(cardiaovascular disease，CVD)是威胁我国公众健康的头号杀手，遗憾的是，目前的治疗策略只能延缓疾病进展，不能让失去的心肌细胞再生。近年来，多项临床前和临床试验证明心脏祖/干细胞(cardiac progenitor/stem cells，CPCs/CSCs)治疗应用于心脏再生修复是可行的、安全的。使用内源性CPCs需要进行心脏活检，这对于危重患者具有较大的风险，因此，需要开发获取外源性心脏祖细胞的方法。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BM-MSCs)具有低免疫原性、免疫调节等优势，已作为自体/同种异体干细胞治疗的候选者。从谱系发育角度看，它和CPCs同起源于中胚层。BM-MSCs向心脏祖细胞方向诱导的重编程技术，将克服它低心脏分化潜能的缺陷，使之成为心脏修复的理想细胞类型。然而，在重编程过程中，染色质状态被认为是跨越细胞表型的最大障碍。所以，寻找新的染色质重塑因子是提高心脏祖细胞重编程效率的突破口。本研究探究AF9在蛋白质重编程BM-MSCs生成心脏祖细胞中的作用及其表观遗传调控机制。
　　方法：1.将pSmartI-MLLT3表达载体，转化至大肠杆菌表达菌株中，优化AF9-His融合蛋白表达条件，利用亲和层析柱纯化AF9蛋白;
　　2.用纳米蛋白转染载体(CN201410823369.2)修饰重组蛋白GATA4、TBX5、NKX2.5、AF9，然后与BM-MSCs孵育12小时，免疫荧光染色观察纳米载体递shDOT1L-2载体成功沉默DOT1L的表达，显著性抑制H3K79双甲基化。ChIP-qPCR结果显示了DOT1L的沉默，削弱了MYH6、MYH7启动子区域H3K79me2的富集。
　　结果和结论：AF9可作为有效的重编程因子，促进心脏转录因子组合GNT诱导BM-MSCs重编程为CPCs，其可能的机制是AF9招募了DOT1L，在GATA4-AF9复合物的引导下，促进心脏关键基因启动子区域的组蛋白H3K79发生二甲基化，激活下游相关基因的表达。
　　因此，表观遗传调控因子AF9在骨髓间充质干细胞向心脏祖细胞重编程过程起着重要的促进作用，本研究优化了蛋白质重编程因子组合，提供了一种新的、有效地获取外源心脏祖细胞的方法，为临床转化创制心肌补片、药物评价奠定研究基础。

目录

摘要

前言

第一章 AF9-His融合蛋白的表达

1 材料和方法

1．1 主要仪器和试剂

1．2 主要试剂的配制

1．3 实验方法

2 结果

2．1 pSmartI-MLLT3质粒的鉴定

2．2 AF9融合蛋白的表达

2．3 重组蛋白AF9的纯化

3 小结

第二章 AF9对纳米蛋白转导技术诱导心脏祖细胞的影响

1 材料和方法

1．1 主要仪器和试剂

1．2 主要试剂的配制

1．3 实验方法

2 结果

2．1 纳米蛋白转导技术的核靶向性

2．2 AF9促进心脏转录因子GNT对BM-MSCs的诱导

2．3 GNTA重编程细胞的心脏特性

2．4 GNTA诱导过程中心脏发育相关基因的mRNA、蛋白水平动态表达

3 小结

第三章 表观遗传调控因子AF9参与心脏祖细胞重编程的机制研究

1 材料和方法

1．1 主要仪器和试剂

1．2 主要试剂的配制

1．3 实验方法

2 结果

2．1 AF9与心脏转录因子GATA4存在相互作用

2．3 稳定DOT1L-／-BM-MSCs细胞系的建立

2．4 敲减DOT1L影响心脏标志基因启动子H3K79me2富集水平

3 小结

讨论

全文总结

参考文献

附录

攻读硕士学位期间的成果

致谢

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