同型半胱氨酸对巨噬细胞CD147表达的影响及他汀的干预作用

摘要

动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)是冠心病的主要病理学基础，其发病机制极其复杂，目前多数学者认同“内皮损伤学说”，即多种危险因素损伤内皮细胞，内膜通透性增高，脂质进入内膜，单核巨噬细胞渗入内膜并吞噬脂质，形成泡沫细胞;泡沫细胞不断凋亡，形成脂质核心，斑块内巨噬细胞分泌基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)，降解细胞外基质，导致纤维帽变薄，逐渐演变为不稳定性斑块。因此巨噬细胞在AS过程起了至关重要的作用。
　　CD147是一种表达于人体多种组织细胞膜上的跨膜糖蛋白，可诱导MMP表达，而MMP可降解构成粥样斑块纤维帽的主要成分，从而加速斑块不稳定。
　　同型半胱氨酸(Homocysteine，Hcy)是90年代被确定为新型的AS独立危险因素，研究证实Hcy诱导多种细胞表达MMP增多，但对其具体机制尚未完全阐明，Hcy是否通过促进MMP的上游分子CD147表达而引起MMP分泌，参与AS发生发展过程，目前鲜有报道。
　　他汀类药物不仅具有强大降脂作用，且能稳定及逆转动脉粥样斑块进展。有研究证实他汀能抑制斑块内CD147及MMP表达，而Hcy是动脉斑块进展的危险因素，他汀能否抑制Hcy诱导的CD147表达，目前未见报道。
　　目的：
　　1、探讨Hcy对U-937来源巨噬细胞CD147表达的影响。
　　2、瑞舒伐他汀干预Hcy处理的巨噬细胞，确定其对Hcy诱导CD147表达的影响。
　　3、MTT检测Hcy、瑞舒伐他汀对U-937来源巨噬细胞活性的影响。
　　方法：
　　1、构建巨噬细胞模型
　　将U937细胞以5×105/L密度接种于细胞板中，加10nmol/L佛波酯(PMA)刺激48h，显微镜下观察细胞形态，确定分化为巨噬细胞。
　　2、Hcy、瑞舒伐他汀干预
　　分化为巨噬细胞后，换无血清培养24h，按如下处理:(1)分别加入浓度为0、50、100、500umol/L的Hcy孵育48h。(2)500umol/LHcy孵育0、12、24、48h。(3)0、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L的瑞舒伐他汀和500umol/LHcy共培养48h。PCR、Westernblot、免疫荧光检测巨噬细胞CD147的表达。
　　3、MTT检测细胞活性
　　将U937细胞以2×104个细胞/孔接种于96孔板中，Hcy、瑞舒伐他汀处理后，加10ulMTT溶液(5g/L)，37℃孵育4h，弃上清，加100ulDMSO，震荡10min，酶标仪上测490nm处吸光度。
　　4、统计学处理
　　实验数据采用x±s表示，应用SPSS21.0统计软件进行单因素方差分析，多组样本均数比较采用LSD-t检验，P＜0.05为差异有统计学意义。
　　结果：
　　1、未处理的U937细胞为形态均一类圆形，呈悬浮生长。PMA处理48h，可见细胞贴壁生长，为梭形、星状或不规则形。
　　2、PCR:CD147mRNA表达量随Hcy浓度升高（或Hcy孵育时间延长）而逐渐增加，其中100、500umol/LHcy组（或24h、48hHcy组）较对照组明显增加(P＜0.05)。瑞舒伐他汀与500umol/LHcy共处理细胞48h后，CD147mRNA随瑞舒伐他汀浓度增加而逐渐减少，其中10-7-10-5mol/L瑞舒伐他汀组CD147mRNA较对照组明显减少(P＜0.05)。
　　3、western blot:CD147蛋白表达量随着Hcy的浓度升高（或Hcy孵育时间延长）而逐渐增加，其中，100、500umol/LHcy组（或24h、48hHcy组）与对照组相比，有统计学意义(P＜0.05)。不同浓度瑞舒伐他汀与500umol/LHcy共处理U-937细胞48h后，CD147蛋白表达量随瑞舒伐他汀浓度增加而逐渐减少，其中10-7-10-5mol/L瑞舒伐他汀组较对照组明显减少(P＜0.05）。
　　4、免疫荧光:0umol/LHcy处理的细胞膜上荧光浅淡，500umol/LHcy处理的荧光明显增强。而10-5mol/L瑞舒伐他汀+500umol/LHcy处理的荧光强度较500umol/L Hcy组明显减弱。
　　5、MTT实验结果:不同浓度Hcy组、不同浓度瑞舒伐他汀组的OD值无统计学差异(P＞0.05)。
　　结论：
　　本研究证实，Hcy能上调U-937来源巨噬细胞CD147的表达，而瑞舒伐他汀能抑制Hcy诱导的CD147表达;一定浓度Hcy和瑞舒伐他汀对U937细胞来源巨噬细胞的活力无明显影响。

目录

摘要

前言

材料与方法

1．1 实验材料

1．2 实验方法

1．3 统计学处理

结果

2．1 巨噬细胞的形成

2．2 PCR检测U-937巨噬细胞CD147mRNA结果

2．3 Western Blot检测U-937巨噬细胞CD147蛋白结果

2．4 细胞荧光试验的结果

2．5 MTT试验

讨论

结论

参考文献

同型半胱氨酸与动脉粥样硬化研究进展

缩写词简表

成果

致谢

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