胚胎MGE前体细胞移植改善TRIM32基因敲除小鼠的自闭症样行为学障碍的研究

摘要

为掌握MGE区前体细胞体外分离提取的方法，检测其GABA神经前体细胞特性标记和神经元定向分化能力;探讨MGE前体细胞移植后的存活、迁移及分化情况;了解MGE前体细胞移植对TRIM32-/-小鼠自闭症样行为学缺陷和脑电图痫性放电的影响。
　　通过体外分离MGE前体细胞，采用细胞免疫荧光染色检测细胞培养后Nestin、Lhx6、Nkx2.1以及GABA、GAD67和PV的表达。采用组织免疫荧光染色检测细胞移植后GFP荧光移植细胞与GABA、GAD67、PV、CR、NPY和NeuN等共染情况，行为学实验检测细胞移植后TRIM32-/-小鼠自闭症样行为的改善情况以及脑电图检测其痫性放电的改变。
　　研究内容和过程如下：
　　1.部分细胞悬液继续培养，分别进行干性维持和定向分化培养，之后进行Nestin、Nkx2.1和LHX6以及GABA、GAD67和PV等蛋白细胞免疫荧光染色。
　　2.细胞密度为1×107个/mL，细胞悬液移植每注射点2ul细胞悬液，注射点海马（±1.8，-2.0，-2.0）和皮层（±1.8，0，-1.0），200nl/min的速度注射细胞悬液，注射完毕留针5min，术前及术后各注射环孢菌素2ml(2ml/g;5ug/g)，连续注射14天。
　　3.MGE前体细胞移植4周后，组织免疫荧光染色GABA、GAD67、PV、CR、NPY和NeuN，统计各标记物阳性细胞在皮层和海马区以及海马伞区域分化成熟后的比例数。
　　4.三室社交偏好实验，社交互动实验，筑巢实验，Y迷宫自发性选择实验，自我捋毛实验等行为学检测MGE前体细胞移植4周后，MGE-NPCs移植TRIM32-/-小鼠、失活MGE前体细胞细胞移植TRIM32-/-小鼠及TRIM32+/+小鼠等实验组行为学评分。
　　5.MGE前体细胞移植4周时检测各实验组移植区域脑电图痫性放电频率的差异。
　　研究结果表明：
　　1.分离出的MGE前体细胞台盼蓝染色80％-90％活细胞。
　　2.MGE前体细胞巢蛋白(Nestin)、NK2同源框1(NKX2.1)、6型LIM同源框蛋白(LHX6)等干细胞及MGE特定蛋白均阳性表达，体外分化后的GABA、GAD67、PV表达阳性比率分别为（0.718±0.091），（0.694±0.058），(0.433±0.08)。
　　3.冰冻脑组织切片免疫荧光显微镜观察移植后MGE前体细胞在海马、皮层和纹状体等区域均有迁移和分化，而非特定迁移区如胼胝体、海马伞等区域细胞迁移和分化少。
　　4.组织免疫荧光染色统计海马区移植后4周时成熟神经元标记NeuN(0.764±0.098)，GABA(0.704±0.124)，GABA合成酶GAD(0.752±0.062)，PV（0.255±0.055），CR（0.193±0.062），NPY（0.163±0.047）。同样，皮层区GABA(0.600±0.107)，GAD67（0.546±0.125），PV(0.171±0.053)，CR（0.100±0.030），NPY（0.130±0.041），NeuN(0.631±0.064)。而在海马伞区GABA、GAD67、PV、CR、NPY、NeuN等均表达阴性。
　　5.组织免疫荧光染色观察部分移植细胞髓鞘碱性蛋白(MBP)和表达突触小泡蛋白(SYP)表达阳性，而基本上所有移植细胞神经胶质纤维酸性蛋白(Glial fibrillary acidic protein，GFAP)阴性表达。
　　6.三室社交偏好实验、社交互动实验、自我捋毛实验、Y迷宫自发性选择实验、筑巢实验等行为学结果显示细胞移植组TRIM32-/-小鼠较对照组TRIM32-/-小鼠均有较明显的改善，与对照组相比有统计学差异(P＜0.05)。
　　7.皮层和海马脑电图记录显示细胞移植组TRIM32-/-小鼠较对照组TRIM32-/-小鼠在痫性放电频率上有明显的减少，与对照组之间差异有统计学意义。(P＜0.05)。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料与方法

2．1 实验材料

2．2 实验常规操作

第三章 结果

3．1 TRIM32转基因小鼠的基因鉴定结果

3．2 MGE-NPCs体外干性鉴定和定向诱导神经元分化结果

3．3 原代MGE-NPCs分别移植海马、皮层、纹状体及海马伞等区域的迁移和分化情况

3．4 原代MGE-NPCs移植在海马区分化成中间神经元的比例

3．5 原代MGE-NPCs移植在皮层区分化成中间神经元的比例

3．6 原代MGE-NPCs移植在海马伞区未分化成中间神经元

3．7 原代MGE-NPCs移植后部分细胞参与突触及髓鞘的形成，未参与小胶质细胞及星形胶质细胞的形成

3．8 MGE-NPCs移植的TRIM32基因敲除小鼠自闭症样的社交障碍及重复刻板样行为表现

3．9 MGE-NPCs移植的TRIM32基因敲除小鼠脑电图痫性放电频率有所减少

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

综述 GABA能中间神经元前体细胞移植的研究进展

中英文缩略词表

攻读学位期间成果

致谢

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