肝纤维化和高脂血症患者隐匿性乙型肝炎病毒感染特征分析

摘要

肝纤维化(hepatic fibrosis)与高脂血症(Hyperlipidemia，HLP)影响数百万人健康，其原因尚未清楚。乙型肝炎是一种常见的疾病，与众多疾病发展相关。国际上把乙型肝炎病毒感染者血清中表面抗原阴性（HBsAg-），而血清或肝组织HBV DNA阳性的人群定义为隐匿性HBV感染(occult hepatitis B virus infection，OBI)。据报道，高脂血症和乙肝、肝纤维化两两之间有关系。但是关于OBI和高脂血症及肝脏纤维化之间关系尚未见报道。
　　目的:研究肝纤维化或高脂血症患者中OBI流行率，检测OBI患者组织病理学变化和OBI病毒株的分子生物学特征。
　　方法:研究对象为江西中医药大学附属医院就诊患者。第一章研究对象为2010年4月-2014年6月高脂血症患者1273人;第二章选取肝纤维化四项指标异常患者1814人（2015年6月-2016年4月）。均进行AST, ALT，GGT以及HBsAg，HBsAg，抗HBc，抗HBs，抗HCV和抗HIV检查。检测样本中HBV-DNA的载量。随后分别对其中确诊为OBI的36例和非OBI的8例患者进行肝穿刺，影像学检查，免疫组化和荧光原位杂交等检测分析。
　　结果:第一章 高脂血症患者隐匿性乙型肝炎感染特征
　　1.分别在9.5％的HLP组和2.4％的对照组中检测到OBI(P=0.001)，两者对比有差异。OBI-HLP患者疫苗接种率显著低于非OBI-HLP患者(2.3％vs.52.2％，P=0.0001）。
　　2.OBI-HLP患者病毒载量中位数值显著高于对照组(P=0.023)。
　　3.OBI-HLP患者血清中，IL-2高于对照组，IL-10水平低于对照组(P=0.02)。
　　4.OBI-HLP患者中，总胆固醇TC水平与HBV-DNA载量呈正相关。
　　5.19名患者BCP/PC片段扩增结果为阳性(79.17％)。其中9个为B型(47.37％)，10个为C型(52.63％)。
　　第二章 肝纤维化患者隐匿性乙型肝炎感染特征
　　1.1814例肝纤维血清四项阳性患者中有148例OBI携带者(8.15％)。肝穿刺36份样本均为OBI阳性，其中分别扩增出12份BCP/PC、13份PreS/S DNA片段。PreS/S区域氨基酸位点变异与OBI发生机制有着密切关系。
　　2.OBI患者肝纤维四项均值(ng/ml)分别为HA100.3±33.5，LN38.5±14.8，PCⅢ22.5±13.5，CⅣ35.7±10.7。 OBI组和对照组之间LN水平没有统计学差异(p＞0.05)，OBI组血清中HA，PCⅢ，CⅣ水平均高于Control组(p＜0.05)。
　　3.肝穿刺患者肝脏硬度LSM值均值12.3±3.6 Kpa; FISH光密度值均值为16.3±3.6。肝穿刺组织中HBsAg，HBcAg表达阳性率分别为2.8％和52.8％。
　　4.OBI患者血清中透明质酸(HA)和HBV DNA载量之间、组织病理评分和HBV DNA载量之间、HBcAg组化评分和HA之间、肝脏硬度值(LSM)和HBV-DNA载量之间均呈正相关。
　　结论:
　　1.高脂血症及肝纤维化人患者中OBI流行率显著高于正常献血或对照人群。
　　2.控制患者血脂水平可能对抑制乙肝病毒复制有效。
　　3.肝纤维化的OBI患者中，组织病理以及肝脏影像值和HBV DNA水平正相关，及早发现OBI，控制OBI发展对控制肝纤维化尤为重要。
　　4.一部分肝纤维化-OBI患者中，扩增出BCP/PC和PreS/S片段，发现了一些有意义的突变位点。有望阐述OBI在特定人群中的发病机制。

目录

摘要

前言

第一章 高脂血症患者隐匿性乙型肝炎感染特征

1．1 材料

1．1．1 研究对象

1．1．2 主要试剂和实验耗材

1．1．3 主要溶液配制

1．1．4 主要仪器

1．2 方法

1．2．1 患者招募流程

1．2．2 样品血清学检测

1．2．3 乙肝病毒核酸提取

1．2．4 样品乙肝病毒载量的荧光定量PCR

1．2．5．BCP／PC片段巢式PCR

1．2．6 检测OBI-HLP患者血清中IL-2与IL-10的表达水平

1．2．7 统计分析

1．3 结果

1．3．1 研究人群临床资料

1．3．2 HLP组和对照组的临床生化指标

1．3．3 高血脂患者与隐匿性HBV感染的关联

1．3．4 OBI-HLP患者IL-2，IL-10水平

1．3．5 TC水平和HBV载量之间相关性分析

1．3．6 OBI-HLP患者BCP／PC区的基因突变位点

1．4 讨论

1．4．1 OBI患者中白介素IL-2，IL-10水平变化

1．4．2 OBI-HLP患者TC水平和HBV-DNA载量之间相关性

1．4．3 OBI-HLP患者BCP／PC片段基因突变

1．5 小结

第二章 肝纤维化患者隐匿性HBV感染特征

2．1 材料

2．1．1 研究对象

2．1．2 主要试剂和主要实验耗材

2．1．3 主要溶液配制

2．1．4 主要仪器

2．2．方法

2．2．1 入院检查流程

2．2．2 血清肝脏纤维四项指标检测

2．2．3 样品生物化学与免疫学指标检测

2．2．4 血清HBV-DNA NAT检测

2．2．5 乙肝病毒DNA提取

2．2．6 样品DNA荧光定量检测

2．2．7 引物设计

2．2．8 OBI样品BCP／PC、Pre-S／S片段的Nested-PCR扩增

2．2．9 OBI样品BCP／PC、Pre．S／S片段的基因序列测定以及HBV野毒株全基因参照序列的获取

2．2．10 肝组织穿刺检查

2．2．11．肝组织标本固定和切片

2．2．12 苏木精-伊红染色(hematoxylin-eosin staining，HE)

2．2．13 Masson染色

2．2．14 组织病理评分

2．2．15 免疫组织化学染色

2．2．16 免疫组化评分

2．2．17 荧光原位杂交FISH检测

2．2．18 肝脏瞬时弹性硬度(Fibroscan)检查

2．2．19 统计分析

2．3 结果

2．3．1 研究对象一般情况资料

2．3．2 OBI患者血清生化指标

2．3．3 肝纤维化四项指标水平比较

2．3．4 OBI患者血清HBV-DNA载量测定

2．3．5 OBI患者肝脏组织病理学检查

2．3．6 HBcAg和HBsAg在肝脏组织中的表达

2．3．7 肝穿组织免疫荧光原位杂交(FISH)实验

2．3．8 肝穿刺患者的Fibroscan检查结果

2．3．9 肝穿组织FISH与免疫组化结果分析

2．3．10 肝穿刺患者肝纤维化四项、HBV-DNA载量与LSM值

2．3．10 HBV-DNA与HA、LSM、IHC评分、HAI评分之间相关性

2．3．11 OBI患者血清BCP／PC片段和PreS／S片段Nested-PCR结果

2．3．12 隐匿性乙型肝炎病毒感染样品的外膜蛋白序列特征

2．4 讨论

2．4．1 肝纤维化患者中OBI的发生率分析

2．4．2 PreS／S片段Nest-PCR结果分析

2．4．3 肝纤维化指标和OBI之间的相关性

2．5 小结

全文总结

参考文献

综述 隐匿性HBV感染与原发性肝细胞癌相关性的研究进展

中英文对照缩略词语表

攻读学位期间的研究成果

致谢

声明