非共平面多氯联苯对哺乳动物细胞诱发微核和细胞周期阻滞的作用

摘要

多氯联苯(Polychlorinated biphenyls，PCBs)是一类迄今仍然受到普遍关注的环境持久性有机污染物，具有生物毒性、生物蓄积性、难降解性以及远距离迁移性等特征。PCBs与神经系统、内分泌系统、以及血液系统等多系统疾病的发生有关，于2013年被国际癌症研究机构(IARC)列为人类第一类致癌物。根据PCBs分子中氯取代基的数目及在两个苯环上所处位置不同而分为209个同系物，其中大部分能在环境样本中能检测出。
　　大多数低氯化的PCBs被认为需经生物转化酶如细胞色素P450(CYP)代谢活化后才能发挥其遗传毒作用。然而，近期的初步研究发现，几种PCBs对并不具有生物转化酶[包括CYP、葡萄糖醛酸基转移酶(UGTs)和硫酸基转移酶(SULTs)活性的中国地鼠肺(V79)细胞系以及其亚克隆（V79-Mz）细胞系诱发微核形成，提示某些PCBs化合物原型（而非代谢物）具有遗传毒性的可能;本课题拟进一步探讨和确认这一可能性。
　　本研究选取了6个三氯联苯及4个四氯联苯化合物作为受试物，分析其对V79和V79-Mz细胞(p53表达缺失)诱发微核的作用;对于其中作用较强的2个代表性化合物，观察它们对人肝细胞瘤(HepG2)细胞(p53功能完整)对细胞增殖活性的影响、诱发微核作用、对V79和V79-Mz细胞诱发Hprt基因突变、对细胞有丝分裂指数的影响和对细胞分裂周期干扰作用;并进一步分析了细胞周期相关蛋白表达水平的改变。在4个受试的四氯联苯化合物中，PCB74和PCB66作为非共平面结构化合物，分别与共平面化合物PCB77和PCB81具有极为相似的化学结构（苯环连接键邻位有无氯取代基是它们之间的唯一结构差异）。结果显示，PCB74和PCB66诱导V79-Mz细胞的微核试验结果为阳性，然而PCB77和PCB81的实验结果为阴性。在受试的三氯联苯化合物中，PCB20和PCB22从10μM浓度开始即强烈诱发微核，其作用明显强于PCB16、PCB17、PCB18及PCB28。因此选取PCB20和PCB22作为代表性PCBs化合物进行更深入的研究。根据CCK-8试验结果，PCB20和PCB22对V79-Mz细胞在10μM浓度出现细胞毒作用，对HepG2细胞则在80μM浓度时才呈现细胞毒作用;并且，PCB20和PCB22在浓度为10μM时V79-Mz细胞的形态出现明显改变，对于V79细胞则在20μM浓度时出现明显改变。微核试验结果表明，PCB20和PCB22诱发V79、V79-Mz和HepG2细胞微核形成（在p53功能健全的HepG2细胞观察到的阳性结果有助于排除与V79和V79-Mz细胞p53缺陷有关的假阳性遗传毒性反应的可能性），其中对V79-Mz细胞的作用最强烈;然而，PCB20和PCB22对V79-Mz细胞诱发Hprt基因突变试验结果为阴性。此外，PCB20和PCB22均能增高V79和V79-Mz细胞的有丝分裂指数，并诱导G2/M期阻滞，且V79-Mz细胞比V79细胞敏感。同时PCB20在相对高的受试浓度(200μM)时使HepG2细胞G2/M期比例增高。蛋白印迹试验的初步结果显示，PCB20可能诱导HepG2细胞的周期相关蛋白Cyclin B1和CDK1表达量升高，而p27表达量则下降。
　　综上，本研究结果表明:部分三氯联苯及四氯联苯在缺乏CYPs酶活性的哺乳动物细胞可呈现细胞毒作用、诱发微核作用、有丝分裂阻滞以及细胞周期G2/M期比例增高，V79-Mz细胞尤其敏感;PCBs诱发微核与细胞毒作用与其化学结构密切相关:2，3，3'-和2，3，4'-三氯联苯的作用强度明显高于其它受试PCBs;PCB20诱导HepG2细胞G2/M期阻滞，以及周期相关蛋白的改变:Cyclin B1和CDK1表达升高、p27表达下降。由于CYP2E1已被证实为非共平面PCBs的主要活化酶，而本研究所采用的所有三个细胞均缺乏CYPs（尤其CYP2E1）活性，因此推断本研究所观察到的效应与PCBs的代谢无关。

目录

摘要

第一章 前言

1．1 引言

1．2 多氯联苯理化特征及其污染现状简介

1．3 PCBs的化学结构与毒性的关系

1．4 多氯联苯的生物转化

1．5 多氯联苯对生物系统的毒性研究

1．6 多氯联苯致癌作用的可能机制

1．7 细胞周期与癌症发生

1．8 细胞周期的调控

1．9 本研究的前期基础

1．10 本课题研究的意义

2．1 主要仪器和试剂

2．1．1 主要仪器

2．1．2 细胞

2．1．3 主要试剂

2．1．4 试剂配制

2．2 实验内容与方法

2．2．1 细胞培养

2．2．2 细胞增殖-活性检测

2．2．3 细胞形态学观察

2．2．4 微核试验(Micronucleus test)

2．2．5 Hprt基因突变试验

2．2．6 有丝分裂指数(mitosis index，MI)分析

2．2．7 流式细胞术检测细胞周期

2．2．8 Western Blot法检测周期相关蛋白

2．2．9 统计学分析

3．1 细胞培养

3．2 细胞增殖活性检测

3．3 细胞形态观察

3．4 10个受试PCBs分别对V79和V79-Mz细胞诱发微核作用

3．5 PCB 20和PCB 22对HepG2细胞诱发微核作用

3．6 Hprt致基因突变试验

3．7 PCB 20和PCB 22对V79和V79-Mz细胞有丝分裂指数的影响

3．8 PCB 20和PCB 22对受试细胞周期分布的影响

3．9 PCB 20对HepG2细胞某些细胞周期相关蛋白表达的影响

第四章 讨论

第五章 结论

参考文献

英文缩略语词汇表

攻读学位期间发表的论文

附录

致谢

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