乌司他丁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部炎症的作用及机制初步探讨

摘要

目的：本研究从体内动物实验角度探讨乌司他丁抑制香烟烟雾刺激所致炎症反应、保护由慢阻肺引起的肺组织损伤的作用以及相关机制;并探讨乌司他丁对香烟烟雾刺激Ⅱ型肺泡上皮细胞所致炎症因子的抑制作用。
　　方法：1.将SPF级雄性SD大鼠随机分为对照组(n=10)、慢阻肺组(n_10)以及乌司他丁组(n=10)，其中对照组大鼠经气管灌注生理盐水（100μL/只），但未形成慢阻肺;慢阻肺组采用香烟烟雾暴露和气管内滴注脂多糖（100μL/只）的复合成型法制备慢阻肺模型;乌司他丁组建立大鼠慢阻肺模型后，实验第29天开始于尾静脉注射100000U/日的乌司他丁，每日两次，连用7天。利用小动物肺功能仪检测各组大鼠0.3秒用力呼气容积(forced expiratory volume in0.3second，FEV0.3)、用力肺活量（forced vital capacity,FVC）、呼气峰流速(peak expiratory flow,PEF)等肺功能指标，观察肺组织的外观以及HE染色病理组织变化情况。采用TUNEL实验检测各组大鼠肺组织细胞凋亡情况，同时采用荧光定量PCR和western blot法检测各组大鼠肺组织中Toll样受体-4(toll-like receptor4，TLR-4)、髓系分化因子88（myeloid differentiation factor88，MyD88）、肿瘤坏死因子受体相关因子-6（tumor necrosis factor receptor associated factor-6，TRAF-6）、血凝素样氧化低密度脂蛋白受体-1(lecktin-like oxidized low density lipoprotein receptor-1，LOX-1)、高迁移率族蛋白1(high mobility group box-1protein，HMGB1)mRNA和蛋白的表达水平。Pearson相关分析法分析TLR-4与HMGB1的相关性，Spearman相关分析法分析TLR-4，HMGB1蛋白表达水平与大鼠肺功能指标的相关性。
　　2.分离培养SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞（AT-Ⅱ细胞），并运用HE染色法、电子显微镜以及改良巴氏染色法进行鉴定。采用香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)刺激AT-Ⅱ细胞，用于模拟慢阻肺发病起始阶段时上皮细胞的变化情况，随后运用乌司他丁进行干预，筛选最佳CSE、乌司他丁作用浓度以及作用时间;通过CCK-8法检测对照组（AT-Ⅱ细胞进行常规培养）、CSE组（向细胞中加入100μg/mL CSE溶液100μL）、乌司他丁组（向细胞中加入10000U/mL乌司他丁溶液，培养24h后向细胞中加入100μg/mL CSE溶液100μL）2h后AT-Ⅱ细胞增殖情况，同时检测各组细胞培养液上清IL-6、IL-8、TNF-α表达水平的变化。
　　3.利用SPSS19.0统计软件对所有数据进行统计处理。
　　结果：1.小动物肺功能仪检测对照组、慢阻肺组、乌司他丁组大鼠肺功能，结果显示，FEV0.3在各组分别为5.56±0.31、3.89±0.32、5.07±0.41ml，FVC在各组分别为6.68±0.43、4.71±0.39、6.11±0.45ml，FEV0.3/FVC在各组分别为90.10±2.78％、74.24±2.31％、83.26±2.56％，PEF在各组分别为36.78±3.89、26.16±3.12、32.48±3.26ml/s，与对照组相比，慢阻肺组大鼠肺功能指标均显著降低(P＜0.05);而与慢阻肺组相比，乌司他丁组肺功能指标均显著升高(P＜0.05)。
　　2.与对照组相比，慢阻肺组大鼠肺组织结构受损，大量炎症细胞浸润，大量肺泡被破坏;而乌司他丁组大鼠肺组织结构较为完整，破坏的肺泡数量减少，炎症细胞浸润程度明显缓解。TUNEL实验结果显示，对照组大鼠的肺组织中能够观察到少量凋亡细胞呈散在分布;慢阻肺组细胞中可见数量较多的TUNEL染色阳性细胞;乌司他丁组与慢阻肺组相比TUNEL染色阳性细胞数量明显减少，与对照组接近。
　　3.采用2-ΔΔCt分析法对荧光定量PCR结果进行分析，以得到相对基因表达差异的倍数，结果显示，TLR-4mRNA在慢阻肺组、乌司他丁组相对于对照组分别为2.78±0.31、1.67±0.26，MyD88分别为2.67±0.28、1.98±0.25，TRAF-6分别为2.34±0.41、1.85±0.36，LOX-1分别为1.89±0.29、1.38±0.37，HMGB1分别为3.31±0.35、2.01±0.29，与对照组相比，慢阻肺组和乌司他丁组肺组织中TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1mRNA的表达水平明显增高(P＜0.05);与慢阻肺组相比，乌司他丁组TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1mRNA的表达水平明显降低(P＜0.05)。
　　4.Western Blot检测对照组、慢阻肺组、乌司他丁组TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1蛋白表达情况，结果显示，TLR-4在各组分别为0.82±0.11、1.21±0.12、0.93±0.10，MyD88在各组分别为0.56±0.12、0.73±0.11、0.61±0.10，TRAF-6在各组分别为0.58±0.14、0.76±0.13、0.62±0.10，LOX-1在各组分别为0.51±0.09、0.95±0.10、0.72±0.11，HMGB1在各组分别为0.79±0.14、1.36±0.15、1.04±0.13，与对照组相比，慢阻肺组和乌司他丁组肺组织中TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1蛋白的表达水平明显增高(P＜0.05);与慢阻肺组相比，乌司他丁组TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1蛋白的表达水平明显降低(P＜0.05)。
　　5.TLR-4和HMGB1蛋白的表达水平在对照组、慢阻肺组和乌司他丁组中均呈正相关(r=0.764，P=0.010;r=0.814，P=0.004;r=0.805，P=0.005)。FEV0.3与TLR-4、HMGB1蛋白表达水平之间存在显著负相关(r=-0.845，P＜0.001;r=-0.820,P＜0.001)。
　　6.AT-Ⅱ细胞HE染色结果显示，细胞的胞浆内含有大量的深色颗粒，颗粒周围有白晕，上述特征与肺泡Ⅱ型上皮细胞的特征相符。电子显微镜观察结果显示，视野下能够观察到多个褐色板层小体分布于细胞核周围，板层结构大小不一且呈同心圆或者平行排列，其中有部分板层小体已经释放。细胞膜以及细胞核的结构完整，在细胞浆中可观察到多种细胞器，线粒体含量丰富。细胞浆中含有粗面内质网与高尔基复合体等细胞器。改良巴氏染色法观察结果显示，细胞的包浆内含有大量深色颗粒，在颗粒周围可见白晕。在计数的400个细胞中，有364个AT-Ⅱ细胞，由此计算获得分离培养的细胞中AT-Ⅱ细胞所占的比例为90％。
　　7.CCK-8实验结果表明，AT-Ⅱ细胞在乌司他丁浓度为10000U/mL，作用24h时增殖活性最高，在CSE浓度为100μg/mL、作用2h时增殖活性最低。因此本研究采用上述浓度及作用时间为实验条件，采用CCK-8实验检测对照组、CSE组、乌司他丁组细胞增殖情况，结果显示，对照组、CSE组、乌司他丁组OD450分别为1.24±0.73、0.56±0.12、0.91±0.25，与对照组相比，CSE组和乌司他丁组细胞的增殖活性明显降低(P＜0.05);与CSE组相比，乌司他丁组细胞的增殖活性明显增高(P＜0.05)。
　　8.ELISA法检测对照组、CSE组、乌司他丁组细胞培养上清中IL-6、IL-8和TNF-α表达水平，结果显示，各组IL-6分别为0.71±0.12、2.65±0.77、1.42±0.56pg/mL，IL-8分别为0.39±0.08、1.51±0.65、0.68±0.32pg/mL，TNF-α分别为0.73±0.11、2.79±0.72、1.28±0.35pg/mL，与对照组相比，CSE组和乌司他丁组细IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平明显增高(P＜0.05);与CSE组相比，乌司他丁组细胞IL-6、IL-8和TNF-α的表达水平明显降低(P＜0.05)。
　　结论：1.乌司他丁对于由香烟烟雾联合气管滴注脂多糖的复合成型法所致的慢阻肺大鼠肺功能具有保护作用。
　　2.乌司他丁对由香烟烟雾联合气管滴注脂多糖的复合成型法所致的慢阻肺大鼠模型肺组织的炎症具有抑制作用，可能与其能够抑制肺组织中TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1的表达有关。
　　3.TLR-4与HMGB1蛋白的表达水平呈正相关，FEV0.3与TLR-4、HMGB1蛋白表达水平之间存在显著负相关，提示乌司他丁可能通过抑制TLR-4/HMGB1信号通路引起的炎症反应，保护由慢阻肺造成的肺组织损伤。
　　4.香烟提取物刺激能够使体外培养的AT-Ⅱ细胞分泌的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α水平显著增高;采用乌司他丁进行干预后，AT-Ⅱ细胞分泌的促炎因子IL-6、IL-8和TNF-α的含量明显降低。

目录

摘要

前言

第一章 乌司他丁对慢性阻塞性肺疾病大鼠肺部炎症的影响

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要实验试剂

1．3 主要实验仪器

1．4 主要溶液配制

1．5 引物的设计与合成

2 方法

2．1 慢阻肺大鼠模型的建立

2．2 实验分组

2．3 大鼠肺功能测定

2．4 肺组织病理变化观察

2．5 TUNEL实验

2．6 荧光定量PCR检测

2．7 western Blot法检测TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1蛋白的表达

2．8 统计学分析

3 结果

3．1 大鼠肺功能检测结果

3．2 肺组织观察结果

3．3 病理组织学观察结果

3．4 肺组织细胞凋亡检测结果

3．5 TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1 mRNA表达检测结果

3．6 TLR-4、MyD88、TRAF-6、LOX-1、HMGB1蛋白表达检测结果

3．7 大鼠肺组织中TLR-4和HMGB1蛋白表达的相关性分析

3．8 TLR-4，HMGB1蛋白表达水平与大鼠肺功能指标的相关性分析

4 讨论

第二章 乌司他丁对香烟烟雾刺激AT-Ⅱ细胞所致炎症反应的影响

1 材料

1．1 实验动物

1．2 主要实验试剂

1．3 主要实验仪器

1．4 主要溶液配制

2 方法

2．1 香烟烟雾提取物(cigarette smoke extract，CSE)的制备

2．2 尼古丁含量检测

2．3 SD大鼠肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT-Ⅱ)的分离和培养

2．4 AT-Ⅱ细胞鉴定

2．5 细胞增殖和毒性分析

2．6 乌司他丁对CSE作用后AT-Ⅱ细胞增殖的影响

2．7 ELISA检测

2．8 统计学分析

3 结果

3．1 台盼蓝拒染实验检测结果

3．3 HE染色结果

3．4 电镜观察结果

3．5 改良巴氏染色结果

3．7 CSE对AT-Ⅱ细胞增殖的影响

3．9 乌司他丁对CSE作用后AT-Ⅱ细胞中IL-6表达的影响

3．10 乌司他丁对CSE作用后AT-Ⅱ细胞中IL-8表达的影响

3．11 乌司他丁对CSE作用后AT-Ⅱ细胞中TNF-α表达的影响

4 讨论

结论

参考文献

综述 高迁移率族蛋白B1的病理生理学特点及其在慢性阻塞性肺病中的作用

英文缩略词表

攻读博士学位期间研究成果

致谢

声明