NR3C1基因突变在急性淋巴细胞白血病耐药中的作用与机制研究

摘要

急性淋巴细胞白血病(Acute Lymphoblastic Leukemia，ALL)是一类基因背景高度异质性的血液系统恶性克隆性疾病，是儿童常见的恶性肿瘤。随着ALL的治疗方法不断更新完善，ALL患者的生存率得到了长足的提高，但仍有相当一部分患者在治疗中发生耐药、复发。糖皮质激素是治疗ALL的主要药物之一，应用于ALL不同化疗方案之中。对糖皮质激素治疗反应性是ALL治疗疗效的独立预后因素。糖皮质激素耐药是ALL治疗失败的重要因素，关于糖皮质激素耐药机制尚不明确，已有报道发现儿童ALL患者化疗后复发时特异性获得NR3C1基因缺失。本课题组在前期研究中，首次利用全基因组外显子测序技术筛选出成人ALL发生异基因造血干细胞移植后复发时，复发白血病细胞特异性获得糖皮质激素受体编码基因-NR3C1的缺失突变（使蛋白合成提前终止），且突变位点位于蛋白的糖皮质激素受体功能区域(exon2：c.431_431delinsAG(p.D144Efs×11))。本研究在前期研究基础上进一步围绕NR3C1基因突变，通过体外细胞实验研究明确NR3C1基因突变对糖皮质激素受体蛋白功能、糖皮质激素促白血病细胞凋亡信号通路的影响，及诱导ALL耐药的分子机制。
　　目的：
　　本研究为明确NR3C1基因突变对NR3C1蛋白生物学功能的影响，探讨NR3C1基因突变致ALL耐药的可能机制，为ALL耐药探索有效的干预治疗靶点。
　　方法：
　　(1)用CCK8法检测ALL细胞株(Reh、Jurkat、CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6)在地塞米松（Dexamethasone，DEX）不同药物浓度(0.1umol/1、0.5umol/1、1.0umol/1、2.5umol/1、5umol/1)作用24h、48h的细胞增殖率;利用免疫蛋白印迹技术(western blot)、荧光定量PCR技术检测ALL细胞株内源性NR3C1表达情况，分析ALL细胞株内源性NR3C1表达与对地塞米松敏感性的关系。
　　(2)采用慢病毒转染的方式使得ALL耐药株过表达NR3C1蛋白，利用流式细胞术以及CCK8法分别检测过表达NR3C1的ALL耐药株在1uMDEX作用48h后的凋亡率和细胞增殖率，明确NR3C1是否能够逆转ALL细胞株耐药性。
　　(3)采用CRISRP/CAS9技术靶向敲除ALL敏感株的NR3C1基因的第二号外显子，利用流式细胞术以及CCK8法分别检测ALL敏感株在NR3C1敲除后对1uM DEX作用48h后的凋亡率和细胞增殖率，进一步明确NR3C1表达与ALL细胞株对地塞米松敏感性的关系。
　　(4)耐药ALL细胞株Reh分别转染NR3C1基因野生型(Reh-WT)和质粒空载体(Reh-vector)，用1umol/1DEX作用48h，提取总RNA，进行文库构建及库检。文库质控合格后，进行全基因转录组水平测序，将原始测序数据经过过滤后得到的数据进行生物信息分析。
　　(5)过表达NR3C1以及敲除NR3C1的ALL细胞株在1uM DEX处理48h后，利用western blot技术检测其PI3K→AKT→GSK3β信号通路相关蛋白以及BCL-2家族前凋亡蛋白和抗凋亡蛋白表达情况。
　　统计学方法：应用SPSS20.0软件统计分析数据，所有实验进行至少三次生物学重复，两组间比较采用独立样本t检验，多组间比较采用多重方差分析，计量资料均以（X±S）表示。检验水准α=0.05，双侧检验。
　　结果：
　　(1)通过CCK8法发现，ALL细胞株Reh、Jurkat对DEX耐药，而CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞对DEX敏感，呈剂量和时间依赖。此外，western blot技术、荧光定量PCR技术检测发现，Reh、Jurkat细胞内源性NR3C1低表达，CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞高表达内源性NR3C1。
　　结果提示细胞内源性NR3C1表达与ALL DEX敏感性正相关。
　　(2)过表达NR3C1可以增强ALL耐药株对地塞米松的敏感性。在1umol/1DEX作用48h后，过表达NR3C1的Reh细胞组(Reh-WT)较阴性对照组(Reh-vector)的细胞增殖率明显降低（0.6467±0.03215，1.06±0.19123;p＜0.05）、细胞凋亡率明显增高（33.6％±0.34641％，6.5％±0.17321％;p＜0.001）;同样，过表达NR3C1的Jurkat细胞组(Jurkat-WT)较阴性对照组(Jurkat-vector)的细胞增殖率明显降低（0.45±0.0721，0.9733±0.00577;p＜0.001）、细胞凋亡率明显增高（57.4％±0.8888％，4.2333％±0.3214％;p＜0.001）。
　　(3)NR3C1基因敲除可以使得ALL敏感株获得对地塞米松的耐药性。在1umol/1DEX作用48h后，敲除NR3C1基因的CCRF-CEM(KO组)较阴性对照组（WT组）细胞增殖率明显增高（0.93±0.12vs0.15±0.04;p＜0.001）、细胞凋亡率明显降低（5.1±1.7％vs79.4±15.4％;p＜0.001）;6T-CEM细胞KO组较WT组细胞增殖率明显增高（0.95±0.055vs0.16±0.006;p＜0.001）、细胞凋亡率明显降低（2.05±1.2％vs67.4±4.2％;p＜0.001）;Nalm6细胞KO组较WT组细胞增殖率明显增高（0.91±0.11vs0.21±0.007;p＜0.001）、细胞凋亡率明显降低（3.2±1.5％vs67.8±0.5％;p＜0.001）。
　　(4)耐药ALL细胞株Reh分别转染NR3C1基因野生型(Reh-WT)和质粒空载体(Reh-vector)，用1umol/1DEX作用48h后，全基因转录组水平测序结果，以Reh-vector组作为对照组，Reh-WT组PI3K相关基因PIK3CD下调，PIK3R6、PIK3R5、PIK3R2基因上调，AKT3、GSK3β上调，前凋亡蛋白相关基因BCL2L11（编码Bim蛋白）、BMF、BOK上调，抗凋亡蛋白相关基因BCL2（编码Bcl-2蛋白）、BAG2下调。
　　(5)过表达NR3C1以及敲除NR3C1基因的ALL细胞在1umol/1地塞米松作用48h后，利用western blot检测发现，过表达NR3C1可以激活ALL细胞的PI3K→AKT→GSK3β信号通路，促进BCL-2凋亡家族的前凋亡蛋白(Bad、Bim)表达，抑制抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL)表达。敲除NR3C1后可以逆转这一现象。
　　结论：
　　(1)ALL细胞株内源性NR3C1表达与ALL对糖皮质激素的敏感性呈正相关;
　　(2)过表达NR3C1可以逆转ALL耐药株对地塞米松的耐药性;
　　(3)敲除NR3C1使ALL敏感株获得对地塞米松的耐药性;
　　(4)NR3C1通过激活PI3K→AKT→GSK3β信号通路、促进BCL-2促凋亡蛋白(Bad、Bim)表达、抑制BCL-2抗凋亡蛋白(BCL-2、BCL-XL)表达，从而参与ALL细胞对糖皮质激素耐药。

目录

摘要

前言

1．材料和方法

1．1 主要材料和试剂

1．2 实验方法

2．统计分析

3．结果

3．1 明确ALL细胞株对地塞米松的敏感性与内源性NR3C1表达的关系

3．2 过表达NR3C1蛋白逆转ALL耐药株（Reh、Jurkat）对DEX的耐药性

3．3 对DEX敏感的ALL细胞株（CCRF-CEM、6T-CEM、Nalm6细胞）敲除NR3C1基因的表达使细胞获得了对DEX的耐药性

3．4 耐药株Reh细胞过表达NR3C1蛋白后，经DEX作用后行全基因　转录组水平测序以及信息分析

3．5 Western blot检测验证NR3C1在ALL糖皮质激素耐药中的机制

4．讨论

5．结论

参考文献

攻读学位期间成果　

致谢

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