利用生物材料研究microRNA21对肾系膜细胞功能的影响

摘要

慢性肾脏病(CKD)可引起肾脏纤维化，最终导致终末期肾病。探讨肾脏纤维化的机理及防治是当今国际肾脏病医学领域的热点和难点。
　　目前肾脏纤维化机理的研究主要建立在二维(2D)细胞培养体系基础上。然而生长在2D培养条件下的细胞，会丢失细胞表型特征，不能完整重复体内的细胞行为。当前的三维(3D)细胞培养模型尽管与生理条件更为接近，但这些方案普遍构建复杂，培植条件需不断优化。3D打印技术及生物材料的发展为创建新的体外模型模拟肾脏系统生理结构及功能带来希望。
　　CKD患者肠道微生物发生改变，可引起氧化三甲胺(TMAO)代谢异常。TMAO能促进CKD进展，增加其死亡风险。miR-21被认为参与了肾脏纤维化的进程。然而TMAO及miR-21对肾系膜细胞的具体致病机制仍不明确。
　　使用miR-21抑制剂(miR-21i)进行RNA干扰可能是治疗肾脏纤维化的有效途径之一。然而短链miR-21i的载体设计非常困难。虽然非病毒载体在安全性、载荷量及合成方面较病毒载体更有优势。但已有的miR-21i非病毒载体转染效率低，需要通过复杂过程合成。研究证实基于单壁碳纳米管(SWCNTs)的纳米载体可以转染多种细胞穿透性差的小分子药物、蛋白、质粒DNA、siRNA等。但在miRNA转染方面的研究甚少，转染肾系膜细胞的研究未见报道。
　　目的：
　　1.利用3D生物打印聚乳酸(PLA)支架的方式构建一种新的三维系膜细胞(RMCs)培养体系，通过3D模型初步探讨TMAO、miR-21对肾系膜细胞的致病作用。2.通过简单方法设计一种新的基于SWCNTs的miR-21i载体系统，将miR-21i靶向投递到RMCs，为miR-21i转染困难及拮抗肾脏纤维化提供新的思路。
　　实验方法及结果：
　　第一部分：基于3D打印PLA支架建立的三维培养体系中TMAO及miR-21对RMCs功能的影响
　　1.采用熔融沉淀制造技术打印PLA支架，消毒后构建3D-PLA-PBS支架，继续经多巴胺涂覆改性、包被Gelatin或RGD构建3D-PLA-Gelatin、3D-PLA-RGD支架。RMCs接种到置于12孔培养板的3D打印支架上构建3D细胞培养体系。RMCs按常规方法培养于细胞培养板/瓶中为2D细胞培养体系。2.通过倒置相差显微镜及扫描电镜观察RMCs的粘附生长情况。
　　结果显示与2D组相比，3D组细胞增殖更迅速，RMCs沿支架规则排列，细胞间的连接呈现错综复杂的空间网络结构。3D-PLA-Gelatin组与3D-PLA-RGD组RMCs生长状态无差异。3.通过活死细胞染色的方法分析RMCs的增殖活性。
　　结果显示24h时2D组、3D-PLA-PBS组、3D-PLA-Gelatin组、3D-PLA-RGD组间细胞存活率无统计学差异(F=0.815、P=0.521);72h时各组细胞存活率有统计学差异(F=71.441、P＜0.001)。2D组、3D-PLA-Gelatin组、3D-PLA-RGD组间细胞存活率无统计学差异(P＞0.05)，3D-PLA-PBS组细胞存活率低于其余各组(P＜0.05)。
　　结果说明构建的3D-PLA-Gelatin及3D-PLA-RGD培养体系生物相容性好。4.通过CCK-8法检测TMAO对RMCs细胞的增殖-毒性情况。
　　结果表明TMAO浓度≤200μM、作用时间≤72h时细胞毒性小，细胞存活率＞90％，可以安全使用。5.在2D及3D-PLA-Gelatin培养体系中采用RT-qPCR测定TMAO对RMCs表达miR-21的影响(12h);结果显示：2D组、2D+TMAO组、3D组、3D+TMAO组间miR-21的表达具有统计学差异（F值=58.643，P＜0.001）。2D组中TMAO对miR-21表达无影响(P=0.068);3D组中TMAO可促进miR-21表达(p＜0.05)。
　　结果表明基于3D细胞培养体系与2D细胞培养体系获得的实验结论可能不一致。6.采用western blotting检测TMAO对RMCs表达CollagenⅠ、Fn1、Fn2及TGF-β1的影响(72h)。
　　结果显示2D组、2D+TMAO组、3D组、3D+TMAO组间上述蛋白的表达均具有统计学差异（F值分别为302.573，478.053，213.581，470.122;P均＜0.001）。2D组及3D组中TMAO均能上调CollagenⅠ、Fn1、Fn2及TGF-β1蛋白的表达（P均＜0.05）;3D组中上述作用更为显著(p＜0.05)。
　　结果表明3D细胞培养体系可以模拟及恢复体内微环境，增强RMCs的功能，优于2D细胞培养体系。TMAO对RMCs具有直接致病作用。
　　第二部分：设计基于SWCNTs的miR21i纳米系统，研究其对RMCs的转染及功能的影响
　　1.miR-21i纳米系统的构建：SWCNT通过HiPCO方法合成，miR-21i的片段序列为5'-aaaaaaaaUCAACAUCAGUCUGAUAAGCUA-3'，穿膜肽(cell penetrating peptide，CPP)片段序列为NH2-YGRK KRRQ RRRGG GLGA SWHR PDKG KKKKKK-COOH。带负电荷的miR-21i和CPP的正电荷端通过静电作用组装形成miR-21i-CPP复合物，在超声作用下miR-21i或miR-21i-CPP通过疏水作用结合到SWCNT表面组装miR-21i-SWCNT或miR-21-CPP-SWCNT。2.采用原子力显微镜(AFM)及动态散射粒度分析仪(DSL)对miR-21i-SWCNT及miR-21i-CPP-SWCNT载体系统进行表征。AFM结果显示两者分散度良好，后者直径较前者粗，提示miR-21i-CPP缠绕在SWCNT上。DSL测定miR-21i-SWCNT的平均长度约为150.3nm，电位为-17.1mV;miR-21i-CPP-SWCNT的平均长度约为50.34nm，电位为24.7mV。说明CPP赋予载体复合物正电荷，增加miR-21i-CPP-SWCNT的稳定性，使其更利于穿透带负电荷的细胞膜。3.采用CCK-8试剂盒分析制备的miR-21i-SWCNT、miR21i-CPP-SWCNT的细胞毒性。
　　结果显示miR-21i-SWCNT、miR21i-CPP-SWCNT细胞毒性小，在低于300nM及48h内，细胞存活率＞90％，可以安全使用。4.将miR-21i5'端用FAM标记，采用激光共聚焦扫描显微镜(CLSM)追踪PBS组，miR-21i组，miR-21i-CPP组，miR-21i-SWCNT组、miR-21i-CPP-SWCNT组的细胞转染情况。
　　结果显示各组间转染效率有显著性差异（6h，F=57.786，P＜0.001;12h，F值=45.925，P＜0.001）。miR-21i组、miR-21i-CPP组、miR-21i-SWCNT组、miR-21i-CPP-SWCNT组可转染RMCs，但miR-21i-CPP-SWCNT组转染效率最高(与其余各组比较，P均＜0.05)。
　　结果说明SWCNT可运载miR-21i进入RMCs，CPP可以增强SWCNT的穿膜能力及稳定性。5.采用western blotting方法及免疫荧光法检测各miR-21i载体系统对RMCs表达TGF-β1、α-SMA与Smad3的影响。
　　结果显示：miR-21i-CPP组、miR-21i-SWCNT组、miR-21i-CPP-SWCNT组可抑制RMCs表达TGF-β1、α-SMA，但miR-21i-CPP-SWCNT组抑制作用最强（与其余各组比较，P均＜0.05）。各系统对Smad3的表达均无影响(P＞0.05)。
　　结果说明进入RMCs的miR-21i-CPP-SWCNT纳米系统可以顺利释放出miR-21i，通过抑制TGF-β1、α-SMA发挥细胞生物学效应。
　　结论：
　　1.通过多巴胺涂覆改性及包被Gelatin或RGD的方式可构建基于3D打印PLA支架的3D RMCs培养体系。该体系构建方法简单、成本低，模型生物相容性好，实用性强。基于该体系进行肾系膜细胞的生物学研究优于传统2D细胞培养体系。
　　2.TMAO可上调miR-21基因表达，并诱导RMCs分泌炎症因子TGF-β1及CollagenⅠ、FN等细胞外基质蛋白。TMAO对肾系膜细胞具有直接致病作用，miR-21可能参与这一过程。
　　3.一步法制备基于SWCNT和CPP的miR-21i纳米载体方法简便、性质稳定、生物相容性好。
　　4.miR-21i-CPP-SWCNT系统可高效转染RMCs，并顺利释放miR-21i，通过抑制TGF-β1、α-SMA发挥生物学效应。该系统为拮抗肾脏纤维化提供了一个靶向治疗的思路。

目录

摘要

第一部分：基于3D打印聚乳酸支架建立的三维培养体系中TMAO及miRNA21对肾系膜细胞功能的影响

第一章 基于3D打印聚乳酸支架的三维细胞培养体系的构建

1．引言

2．实验材料和方法

3．实验结果

4．讨论

5．本章小结

参考文献

第二章 利用三维细胞培养体系研究TMAO及miRNA21对肾系膜细胞功能的影响

1．引言

2．实验材料和方法

3．实验结果

4．讨论

5．本章小结

参考文献

第二部分：基于单壁碳纳米管研究miRNA21i纳米系统对肾系膜细胞功能的影响

第一章 miRNA21i纳米系统的设计和构建及其表征

1．引言

2．实验材料与方法

3．实验结果

4．讨论

5．本章小结

参考文献

第二章 miRNA21i纳米系统对肾系膜细胞的投递效率及功能的影响

1．引言

2．实验材料和方法

3．实验结果

4．讨论

5．本章小结

参考文献

全文总结

不足之处及研究展望

MicroRNAs投递载体的研究进展

1．MicroRNAs简介

2．MicroRNAs治疗

3．MicroRNAs非病毒载体

4．MicroRNAs载体研究展望

参考文献

中英文对照缩略词表

攻读博士期间发表的论文

致谢

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