生酮饮食联合隔日饥饿导致骨微结构及骨代谢改变的实验研究

摘要

生酮饮食(Ketogenic diet，KD)以低碳水化合物和高脂肪含量为特点，是临床上一种有效的饮食疗法。KD被用于治疗儿童耐药性癫痫已经有近百年的历史，但它所导致的骨量丢失、骨密度下降等副作用不容小觑。通过联合KD与隔日饥饿产生的隔日生酮饮食(Every-other-day ketogenic diet，EODKD)，在诱导生酮水平以及癫痫控制方面展现出了更好的效果，但目前关于EODKD带来的副作用还少有研究，尤其是它对骨结构及代谢的影响是否比KD更为严重还不明确，这对于其临床应用尤其是在小儿癫痫治疗方面具有重要意义。本研究旨在建立KD及EODKD喂养的Sprague-Dawley(SD)大鼠动物模型，对比不同方式的生酮状态下大鼠长骨骨微结构及生物力学性质的改变，从而论证EODKD是否会诱导更严重的骨质疏松，同时探讨酮体代谢导致骨丢失的潜在机制。 （一）生酮及隔日生酮饮食大鼠模型的建立 目的：临床上，KD除了对癫痫有控制作用之外，在减肥、糖尿病、肿瘤以及脊髓损伤等多方面均有治疗效果。既往有大量研究建立了高脂低碳水化合物(High-fat，low-carbohydrate，HFLC)动物模型，并就其带来的副作用进行了探索。KD作为一种特殊的HFLC饮食，目前还未有成熟的动物模型以支持相关研究。此外，前期实验中我们发现KD联合隔日饥饿产生的EODKD，在短期喂养后可以诱导大鼠血清及脑脊液产生更高水平的酮体，而其临床抗癫痫效果可能也优于单纯KD。本章实验旨在建立KD及EODKD喂养的SD大鼠模型，进而对比不同生酮水平下其体重、血糖血酮等代谢的改变。 方法：30只8周龄雄性SD大鼠按体重接近原则随机平均分为对照(Control)组，KD组及EODKD组，分别持续予标准饲料、生酮饲料以及隔日予生酮饲料喂养12周。EODKD组首日晨8点进食，次日晨8点开始饥饿（仅予饮水），以此循环持续。所用的生酮饲料中脂肪与碳水化合物加蛋白质的质量比例接近3∶1。实验期间每周结束时检测各组体重，每两周结束时尾静脉取血检测各组血酮及血糖水平。EODKD组均在禁食日结束时采集血液样本。以单因素方差分析检验各组初始体重、血酮及血糖差异，以重复测量方差分析比较整个喂养过程中各组差异的显著性，事后检验均选择Tukey检验，显著性水平为p＜0.05。 结果：大鼠初始体重、血酮及血糖水平在各组间均无差异。与Control组相比，KD及EODKD组在12周喂养过程中体重明显降低（p=0.042及p=0.013），但两组之间无差异。Control组平均血酮为0.3±0.1mmol/L，而KD与EODKD组分别为1.7±0.6mmol/L及2.7±1.0mmol/L，均显著增高于Control组(p＜0.001)，且KD与EODKD组之间的差异也存在显著性(p=0.016)。Control组平均血糖7.0±0.6mmol/L，显著高于其余两组（p=0.005及p=0.011），而KD与EODKD组平均血糖水平分别为5.9±0.5mmol/L和5.8±0.6mmol/L，无统计学差异。 结论：本章研究成功建立了KD及EODKD喂养的大鼠模型，其总体特征是血酮维持在高水平，而血糖水平相对降低。与KD相比，EODKD可以诱导出更高的酮体水平，但并不会导致血糖的进一步下降。此外，经生酮与隔日生酮饮食喂养的大鼠体重会显著减轻，但两者水平接近。 （二）生酮与隔日生酮状态下骨微结构及代谢对比 目的：骨量减少和骨小梁结构恶化会导致骨脆性增大并且增加骨折风险，因而早期预防显得格外重要。随着KD在临床的广泛应用，关于它引起钙、磷、维生素D代谢紊乱，以及骨密度降低、生长延缓等情况屡有报导，但缺乏相关的动物体实验研究及机制探索。另一方面，EODKD对比KD可以进一步提升酮体水平，且未来可能替代KD作为更有效的饮食治疗方案，因而对比论证EODKD是否会导致更严重的骨丢失效应具有重要意义。本章实验目的即对比研究KD与EODKD对骨微结构及骨代谢影响的不同。 方法：取差异喂养12周后的SD大鼠，麻醉后以双能X射线(Dual Energy X-ray Absorptiometry，DEXA)测量各组大鼠全身骨密度(Bone Mineral Density，BMD)及体脂百分数。取材下肢长骨，用显微CT扫描胫骨平台近端松质骨及皮质骨结构，并以三点弯曲实验测量股骨力学性能。试剂盒检测各组血清中钙、磷及活性维生素D水平，同时检测碱性磷酸酶(Alkaline Phosphatase，ALP)及抗酒石酸酸性磷酸酶(Tartrate-Resistant Acid Phosphatase，TRAP)活性。胫骨近端石蜡包埋切片后行Ⅰ型胶原(COLⅠ)、骨钙素(OCN)免疫组化以及TRAP染色，并半定量计数对比阳性表达率。此外，取各组下肢骨髓间充质干细胞(BoneMarrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)培养诱导成骨分化，通过对细胞ALP活性及钙结节茜素红染色比较各组成骨诱导能力。 结果：与Control组相比，KD及EODKD组均表现出显著减低的BMD以及升高的体脂率，对应的，长骨皮质骨及松质骨量在这两组均有明显减少，力学性能也较Control组明显下降。在骨转化方面，KD与EODKD组的破骨指标显著升高而成骨指标下降。与KD组相比，EODKD在早期干细胞成骨及骨吸收上同时受到明显的抑制，但两者在总体的骨微结构及生物力学性能方面并无统计学差异。 结论：KD与EODKD均可以导致大鼠长骨骨量丢失，其中的机制既有骨形成的减弱也有骨吸收的增强。与KD相比，EODKD在干细胞成骨活性及骨吸收活动上均相对减弱，两者在对总体的骨微结构及力学性能影响方面体现出相似水平。

目录

摘要

前言

第一章生酮及隔日生酮饮食大鼠模型的建立

1．1背景

1．2材料与方法

1．3结果

1．4讨论

1．5结论

第二章生酮与隔日生酮状态下骨微结构及代谢对比

2．1背景

2．2材料与方法

2．3结果

2．4讨论

2．5结论

全文总结

参考文献

综述 生酮饮食诱导骨丢失及其作用机制的研究进展

攻读学位期间成果

致谢

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