肥大细胞通过上调p21促进前列腺癌神经内分泌分化及增加对多西他赛化疗的抵抗性

摘要

目的：
　　前列腺癌是最常见的泌尿系统恶性肿瘤之一。晚期前列腺癌在雄激素剥夺治疗（androgen deprivation therapy,ADT）后出现的去势抵抗型前列腺癌（castrate-resistant prostate cancer,CRPC）预后差，而应用于转移性CRPC(mCRPC)化疗的多西他赛等药物的效果十分有限。
　　神经内分泌分化（neuroendocrine differentiation，NED）是前列腺癌的常见特征，有研究发现ADT可导致前列腺癌细胞的NED，而NED与化疗抵抗性相关。文献报道肥大细胞可以通过促进血管生成，组织重塑等参与肿瘤的发生发展。之前的研究证明了ADT可以募集肥大细胞并抑制雄激素受体(androgen receptor,AR)信号通路促进前列腺癌的NED，但CRPC常不依赖雄激素和AR发生进展和转化。因此本研究旨在进一步探索前列腺癌NED的发生机制。
　　方法：
　　本课题采用Transwell小室进行前列腺癌细胞(LNCaP和C4-2)与肥大细胞(HMC-1)的共培养，观察共培养的前列腺癌细胞的形态改变，MTT实验和克隆形成实验检测前列腺癌细胞活性和增殖能力的影响，CCK8实验检测肥大细胞对前列腺癌细胞多西他赛化疗敏感性的影响，RT-qPCR、western blot实验检测前列腺癌细胞相关mRNA及蛋白表达量。
　　结果：
　　1、前列腺癌细胞与HMC-1共培养后出现NE样形态改变，NE标志物(NSE，chrA，SYP)mRNA及NSE的蛋白表达水平明显上调。
　　2、MTT实验结果发现共培养的前列腺癌细胞生长受到抑制，克隆形成实验提示共培养的前列腺癌细胞克隆形成数量减少。CCK8实验结果提示共培养后发生NED的C4-2细胞在多西他赛化疗后细胞活性受损程度减小。
　　3、Western blot实验提示HMC-1共培养的前列腺癌细胞的AR的表达受到了抑制，同时p21蛋白水平明显上调。C4-2细胞中敲除AR后，NSE表达上调，但p21表达下调;敲除p21后，AR表达水平未受到影响，而NSE表达明显下调。C4-2细胞过表达p21后NSE表达水平上调，同时诱导NE样形态改变。
　　4、进一步RT-qPCR和western blot实验发现在C4-2细胞中敲除p21可以部分逆转肥大细胞共培养导致的NSE上调以及NE样形态改变。CCK8实验结果提示敲除p21也可以部分逆转肥大细胞共培养后出现NED的C4-2细胞的多西他赛化疗抵抗性。
　　结论：
　　本研究验证了肥大细胞浸润可以促进前列腺癌细胞NED，发现了肥大细胞可抑制前列腺癌细胞的增殖能力，降低前列腺癌细胞对多西他赛治疗的敏感性。肥大细胞导致前列腺癌细胞的p21表达上调，p21可以通过AR非依赖的信号通路调控NED，敲除p21可以部分逆转肥大细胞导致的前列腺癌细胞的NED和多西他赛化疗抵抗性，证明肥大细胞部分通过上调p21促进前列腺癌细胞的NED及增加多西他赛化疗抵抗性，针对p21信号通路的靶向治疗可能为前列腺癌临床治疗方法带来新的思路。

目录

摘要

第一章 前言

第二章 材料

2．1 主要仪器

2．2 实验主要试剂及耗材

2．3 主要试剂的配置

第三章 方法

3．1 细胞培养

3．2 MTT实验

3．3 CCK8实验

3．4 平板克隆形成实验

3．5 总RNA的提取、RT-qPCR

3．5．1 总RNA的提取(Trizol法)

3．5．2 RNA定量及逆转录

3．5．3 荧光实时定量PCR

3．6 Western Blot

3．6．1 细胞总蛋白的提取

3．6．2 BCA法测定总蛋白浓度

3．6．3 SDS-PAGE

3．7 质粒转染

3．8 慢病毒包装及转染

3．9 统计学分析

第四章 结果

4．1 肥大细胞对前列腺癌细胞神经内分泌分化的影响

4．2 肥大细胞对前列腺癌细胞的增殖及多西他赛化疗敏感性的影响

4．3 肥大细胞介导的p2 1过表达在前列腺癌细胞神经内分泌分化中的作用

4．4 抑制p21表达可以逆转肥大细胞导致的前列腺癌细胞神经内分泌分化

第五章 讨论

第六章 小结

参考文献

综述：前列腺癌神经内分泌分化的研究进展

致谢

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