重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达及纯化

摘要

胱天蛋白酶募集域蛋白9(caspase recruitment domain-containing protein9，CARD9)是一个参与信号传导的重要衔接蛋白，定位于染色体9q34.3，cDNA全长为2108bp，编码536个氨基酸残基，表达相对分子质量约为62.3kDa的蛋白质。CARD9能结合Bcl10和MALT1从而形成CBM复合体，连接模式识别受体，产生相应的免疫反应来抵抗真菌、细菌及病毒的入侵。MBP由大肠杆菌malE基因编码，是细菌麦芽糖转运系统的成员之一，主要在大肠杆菌中参与麦芽糖的摄取和分解代谢。MBP由371个氨基酸残基组成，其分子量大小约为42kDa，MBP标签主要用于促进蛋白质的溶解性，具有促溶范围广、促溶效率高、且易于纯化等优点，可增加细菌中过量表达的融合蛋白的溶解性，尤其是真核细胞蛋白质。此外，MBP标签可增加目的蛋白的稳定性，与MBP标签分离后，目的蛋白很容易恢复其天然构象。
　　鉴于CARD9在先天性免疫反应方面中扮演的重要角色，解析其蛋白结构进而阐明其功能显得格外重要。迄今，有关CARD9的研究，主要集中在体内免疫和动物实验等方面，而关于其本身蛋白结构的研究暂未见到发表。所以本课题试图通过构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体，并尝试表达和纯化，以期为进一步的研究奠定实验基础。
　　目的：
　　构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体，并对融合蛋白进行表达鉴定及纯化。
　　方法：
　　利用PCR技术分别扩增CARD9和MBP基因的编码序列，将两者通过酶切连接的方法正确插入pET-30a(+)载体中得到重组质粒，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞中，后进行PCR和酶切鉴定以及基因测序。将正确的重组质粒转化至大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，筛选不同条件进行IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE电泳检测目的蛋白质的相对分子质量。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱对CARD9-MBP融合蛋白进行纯化，并尝试用HRV3C蛋白酶过夜酶切去除MBP标签。
　　结果：
　　成功构建CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体，PCR和酶切鉴定为阳性且基因测序结果与目的序列一致。SDS-PAGE电泳显示，在大肠杆菌BL21(DE3)中成功诱导表达出相对分子质量(Mr)约为105000的目的蛋白。通过MBP麦芽糖层析柱的初步纯化后，可得到相对较纯的融合目的蛋白，经过HRV3C蛋白酶过夜酶切去除MBP标签后，CARD9蛋白主要存在于沉淀中。后期将初步纯化的蛋白混合液合并浓缩，通过分子筛层析柱进一步纯化得到了更纯的CARD9-MBP融合蛋白。
　　结论：
　　成功构建了重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达载体，并进行了大量可溶性表达。通过MBP麦芽糖层析柱和分子筛层析柱的纯化，可得到较纯的目的蛋白。

目录

摘要

前言

第一章 重组CARD9-MBP融合蛋白的原核表达构建

1 材料与方法

2 实验结果

第二章 重组CARD9-MBP融合蛋白的纯化

1 材料与方法

2 试验结果

讨论

全文小结

参考文献

综述 CARD9在模式识别受体方面的研究进展

中英文缩略词表

硕士期间研究成果

致谢

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