心血管创新药盐酸椒苯酮胺(PPTA)对QT间期的影响及其作用机制研究

摘要

近年来，药物诱发QT间期延长已成为导致药品撤市的主要原因之一和制药工业亟待解决的重要安全问题。盐酸椒苯酮胺(piperphentonamine hydrochloride，PPTA)是我国自主创新研发的钙增敏剂类强心药及心肌保护剂，已获多项国内外发明专利授权。Ⅰ期临床试验观察到一定比例受试者出现QTc延长的不良事件，研究表明，凡是能够诱导QT间期延长引发尖端扭转型室性心动过速(Torsade de pointes，TDP)的药物均会产生不同程度阻断Ikr/hERG钾通道的作用。鉴于是否引发QT间期延长已成为新药早期临床研究心脏安全性评价的重要内容，且国内外未见对于钙增敏剂类化合物进行心脏安全性评价的报道，本课题对PPTA在临床试验中出现QT间期延长不良事件的原因进行研究，探讨其引发QT间期延长的潜能及其作用机制，为该类化合物临床合理用药提供依据。
　　本文的研究内容如下：
　　(1)采用真核表达载体，运用脂质体转染法将hERG基因与GFP共转到人胚肾细胞（Human embryonic kidney，HEK-293T）中，应用全细胞膜片钳技术探究PPTA对HEK-293T细胞上的hERG钾通道电流(IhERG)的影响，从电生理水平评估PPTA临床应用的心血管安全性。
　　(2)采用Q-PCR/Western Blot法在分子水平上观察不同浓度PPTA对HEK-293T细胞上hERG钾通道mRNA及蛋白水平的影响，进一步完善PPTA作用于hERG钾通道的机制研究。
　　(3)运用在体麻醉动物心电图检测技术检测PPTA对新西兰兔QT间期的影响，构成完整的致心律失常风险评估，并探究QT间期延长与PPTA给药剂量、输注速率之间的联系。
　　本文结果如下：
　　(1)全细胞膜片钳结果表明PPTA浓度依赖性地抑制hERG钾通道的尾电流，其最大半数抑制浓度(Half-maximum block concentrations，IC50)为0.1859μM，约5min达到作用稳态，洗脱后能部分恢复。结合其临床应用最高血药浓度Cmax（0.0012～0.0045μM），IC50/Cmax比值大于30，说明治疗剂量下PPTA的安全范围较高。但在临床高剂量用药或是同服其他引起QT间期延长的药物时应引起关注。
　　(2)Q-PCR/Western Blot结果表明1、3、10μM PPTA可抑制hERG钾通道mRNA的表达及蛋白的转运，抑制作用亦呈现浓度依赖性。
　　(3)动物实验结果显示4mg/kg PPTA快速给药时不引发新西兰兔QT间期延长，输注速率为1333μg/kg/min时引发QT间期延长，且在推注完成即刻新西兰兔QTc值超正常值范围，具有临床意义。说明治疗剂量下PPTA安全性较高，PPTA引发的QT间期延长现象与给药剂量及输注速率有关。
　　本文结论为：PPTA可通过直接抑制hERG钾通道电流及通道转运两种方式来抑制hERG钾通道，电生理结果提示该药具有延长心肌细胞动作电位时程(action potential duration，APD)的作用，但治疗剂量下安全范围较高。动物实验结果显示PPTA剂量过大或输注速率过快有引发QT间期延长风险，提示在临床用药时需要注意药物使用剂量及输注速率，警惕药源性长QT综合征的发生。

目录

摘要

第一章 绪论

1．1 药物的心脏毒性概述——QT间期延长

1．2 bERG钾离子通道与膜片钳技术

1．2．1 hERG钾离子通道电生理学基础

1．2．2 膜片钳技术简介

1．3 药物对hERG钾离子通道的阻断

1．3．1 药物对hERG钾通道的直接抑制效应

1．3．2 药物对hERG钾通道转运的抑制效应

1．4 钙增敏剂PPTA的临床研究进展

1．5 研究内容和研究意义

第二章 PPTA对HEK-293T细胞上的hERG钾通道电流的影响

2．1 前言

2．2 仪器与材料

2．2．1 质粒及细胞株

2．2．2 实验耗材及试剂

2．2．3 实验仪器

2．3 实验方法

2．3．1 药液配制

2．3．2 HEK-293T细胞的培养

2．3．3 质粒转化扩增

2．3．4 细胞转染

2．3．5 hERG钾电流的记录和测量

2．3．6 实验数据处理

2．4 结果

2．4．1 HEK-293T细胞的形态学观察

2．4．2 hERG电流的记录与测量

2．4．3 PPTA对hERG电流具有抑制作用

2．5 讨论

第三章 PPTA对HEK-293T细胞上的hERG钾通道mRNA及蛋白表达的影响

3．1 前言

3．2 仪器与材料

3．2．1 实验细胞株

3．2．2 实验耗材及试剂

3．2．3 实验设备

3．3 实验方法

3．3．1 药液配制

3．3．2 细胞分组加药

3．3．3 Q-PCR实验

3．3．4 Western Blot实验

3．3．5 统计学分析

3．4 实验结果

3．4．1 hERG-HEK细胞的形态学观察

3．4．2 hERG基因的扩增及溶解曲线

3．4．3 PPTA对hERG钾通道mRNA的影响

3．4．4 PPTA对hERG钾通道蛋白的影响

3．5 讨论

4．1 前言

4．2 仪器与材料

4．2．1 实验动物

4．2．2 实验耗材及试剂

4．2．3 实验设备

4．3 实验方法

4．3．1 药物及溶液配制

4．3．2 动物分组及心电图记录

4．3．3 统计学处理

4．4 结果

4．4．1 PPTA引发新西兰兔QT间期延长波形特征

4．4．2 PPTA快速给药对新西兰兔QT间期的影响

4．4．3 PPTA缓慢给药对新西兰兔QT间期的影响

4．5 讨论

全文小结与展望

参考文献

附录

硕士期间攻读成果

致谢

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