二甲双胍通过激活AMPK诱导自噬在大鼠窒息性心脏骤停/心肺复苏模型发挥神经保护作用的机制研究

摘要

目的：
　　心脏骤停(cardiac arrest，CA)是指各种原因引起的心脏射血突然停止，是致死和致残的主要原因。CA的发生率为20～140/10万，随着心肺复苏(cardiopulmonary resuscitation，CPR)技术的进步，约25％～40％的患者能恢复自主循环(retum of spontaneous circulation，ROSC)，但CA患者死亡率仍高达55～71％，即使存活的患者也常遗留严重的神经功能残疾。CA患者在恢复自主循坏后，由于缺血再灌注损害，使机体发生严重的应激反应，引起全身炎症反应综合症，并导致相应的多器官功能障碍，临床上表现为心脏骤停后综合症(post-cardiac arrest syndrome，PCAS)，其主要包括:1、CA后脑损害;2、心肌功能障碍;3、全身性缺血再灌注损伤;4、引起CA的原发病本身变化。由于脑组织对缺血缺氧的耐受性极低以及脑组织的易损性，使得CA后的脑损害表现最为突出，临床上我们称之为成人“缺血缺氧性脑病”(HIE)。CA/CPR导致脑损伤的机制十分复杂，其中严重的能量耗竭是CA后的主要特征之一，在缺血期，ATP合成减少导致线粒体膜电位下降和钙离子流入，从而导致神经元损伤。ROSC后再灌注引起氧自由基的过度生成，可直接损害细胞膜及促进炎症发生。目前唯一被证明有效的治疗手段是亚低温治疗，但亚低温的治疗时间窗窄及存在相关并发症，在临床上的运用仍非常有限。因此，探讨HIE后的脑损伤机制及有效的靶向神经保护剂对降低CA患者在恢复自主循环后的死亡率及致残率有重要的意义。
　　AMP激活蛋白酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞的重要ATP/AMP能量感受蛋白，当糖供能量下降时，细胞可通过AMPK磷酸化产生p-AMPK，诱导脂肪代谢为细胞供能。一旦被激活，AMPK能通过多个下游路径，增加体内ATP水平。研究表明二甲双胍可激活脑内AMPK，通过维持细胞能量平衡、促进线粒体再生、增加脑源性神经营养因子(BDNF)的表达促进神经元的存活，从而在能量耗竭中发挥神经保护作用。作为AMPK下游重要的调控靶点一自噬，在长时程二甲双胍预处理后在CA/CPR诱导的HIE损伤中发挥何种作用尚未有所报道。基于以上研究背景，我们假设二甲双胍预处理可能通过激活AMPK诱导自噬激活，从而减轻CA/CPR引起的缺血性损伤。
　　本研究的目的在于:(1)评估二甲双胍在大鼠窒息性心脏骤停/心肺复苏（asphyxial cardiac arrest/cardiopulmonary resucitaiton，ACA/CPR）模型的神经保护作用;(2)通过自噬的特异抑制剂干预前后比较，阐明自噬在CA/CPR诱导的脑损伤中的神经保护作用;(3)二甲双胍在HIE中对自噬的调节及其发挥神经保护的机制。
　　方法：
　　为达到上述研究目的，我们进行了以下三个部分的研究。具体研究方法和内容分别如下:
　　一、二甲双胍在大鼠9分钟窒息性心脏骤停/心肺复苏(9-min ACA/CPR)模型的神经保护作用
　　采用SD雄性大鼠随机分为二甲双胍组(Met)和对照组(Veh)，Met组给予浓度30mg/ml，200mg/kg剂量的二甲双胍连续灌胃14天，而Veh组灌等量的生理盐水。灌胃后24h分别进行9-min ACA/CPR造模和假手术处理。
　　对对照组(n=20)、二甲双胍组(n=20)以及假手术组(n=5)的大鼠进行7d生存率、神经功能以及病理学损伤评估。利用改良NDS评分量表（0分表示脑死亡，80分表示没有神经功能缺损）评估各组大鼠的神经功能缺损评分;尼氏染色观察大鼠海马CA1区神经元丢失情况;利用免疫组化方法对病理损伤进行评估，分别观察神经元树突(microtubule associated protein，MAP2)、小胶质细胞(ionized calcium bindingadaptor molecule-1，Iba-1)以及星形胶质细胞(glial fibrillary acidic portein，GFAP)相应的表面标志物在各组的表达情况。
　　二、观察自噬及AMPK在9-min ACA/CPR后的激活情况
　　第一部分，ROSC后各个时间点(6h，12h，24h，48h)分别提取二甲双胍组及对照组大脑皮层和海马蛋白，Westem blotting法检测自噬相关蛋白(LC3，p62)及AMPK，p-AMPK蛋白在各组表达水平。第二部分，在ROSC后24h处死大鼠并取脑，随后观察大鼠免疫荧光染色及透射电镜指标，评估各组的自噬表达水平。
　　三、观察长时程二甲双胍预处理对9-min ACA/CPR模型的神经保护作用机制
　　通过自噬抑制剂Chloriquine(CQ，25mg/kg,i.p.)、AMPK抑制剂Compound C(Cc，100nmol/rat，10μl，i.c.v.)干预前后比较，检测CA/CPR损伤后不同脑区（皮层、海马）自噬相关指标及自噬体，同时通过免疫组化法测定神经元树突丢失情况(MAP2)，尼氏染色测定神经元丢失及测定动物神经行为功能，评估二甲双胍治疗对自噬的调节作用及其发挥神经保护的机制。
　　结果：
　　一、二甲双胍显著改善9-min ACA/CPR大鼠的7d生存率和神经功能缺损
　　对照组大鼠的7d累积生存率为55％(11/20)，而二甲双胍组为85％(17/20)，两组相比有统计学差异(x2=4.164，P=0.0413)。ACA/CPR造模后二甲双胍组大鼠在24h、48h和72h的NDS评分与对照组相比，均显著增高（均P＜0.05）。Met给药可显著降低7天海马CA1区存活神经元丢失(P＜0.05)及树突丢失(P＜0.05)。ACA/CPR后大鼠的海马CA1区可见明显的小胶质细胞(Iba-1)和星形胶质细胞(GFAP)活化，Met可明显抑制星形胶质细胞和小胶质细胞的活化(P＜0.05)。此外，对照组在ROSC后24h海马CA1区Cleaved Caspase-3阳性细胞数明显增多，而Met组Cleaved Caspase-3免疫组化染色阳性的细胞数明显较少(P＜0.05)，表明二甲双胍预处理可抑制ACA/CPR诱导的神经元凋亡。
　　二、9-min ACA/CPR后自噬及AMPK被激活，而Met进一步放大这种激活
　　Western blotting表明ROSC后48h，AMPK明显被激活。而在Met组，AMPK激活最早出现在ROSC后6h，且持续升高到48h（P＜0.01）。此外，Met显著增加了CA/CPR诱导的p-AMPK的激活(P＜0.05)。同时，CA/CPR诱导自噬标记蛋白LC3-Ⅱ蛋白随时间变化的积累，LC3-Ⅱ蛋白水平从ROSC后12h开始增加，24及48h达高峰。p62蛋白表达水平从ROSC后12h开始降低，在24及48h进一步衰减。这些结果表明CA/CPR后12h自噬明显被激活，ROSC后24及48h自噬激活达高峰。Met预处理后，24h免疫荧光显示LC3-Ⅱ表达较对照组高(P＜0.01)。同时，电镜可观察到Met组与对照组自噬小体的形成。24及48h的western blotting结果表明Met组与对照组相比自噬进一步被激活（P＜0.05）。
　　三、抑制自噬及AMPK后，二甲双胍的神经保护作用被逆转
　　给予AMPK抑制剂Compound C(Cc)干预后，Met+Cc组大鼠海马、皮层的p-AMPK蛋白水平明显低于Met+Veh组。NDS评分结果表明，与Met+Veh组相比，Met+Cc组大鼠在ROSC后24h，48h及72h的NDS评分均明显降低（均P＜0.05），表明二甲双胍诱导的神经功能改善被Cc取消了。尼氏染色结果显示，Met+Cc组大鼠海马CA1区神经元数量明显低于Met+Veh组（P＜0.01）。另外，Met+Cc组大鼠海马CA1树突损伤较Met+Veh组更明显（P＜0.01）。给予自噬抑制剂Chloriquine(CQ)干预后，Met+CQ组相比Met+Veh组，western blotting结果显示大鼠海马及皮层的自噬被抑制(均P＜0.05)，同时NDS评分表明Met+CQ组大鼠在ROSC后24h，48h及72h的NDS评分均明显降低（均P＜0.05）。尼氏染色及MAP2染色进一步表明，与对照组相比，CQ明显减少了大鼠海马CA1区神经元数量并加重了树突损伤（均P＜0.01）。此外，Cc明显降低了大鼠在ROSC后24h海马及皮层的LC3-Ⅱ蛋白的表达水平，提示二甲双胍预处理在CA/CPR脑损伤中通过激活AMPK诱导自噬的进一步激活。
　　结论：
　　一、二甲双胍可以改善q-min ACA/CPR大鼠的7d生存率、神经功能评分以及海马CA1区的神经元丢失，抑制海马CA1区胶质细胞活化。
　　二、二甲双胍可导致CA/CPR大鼠早期并持续的AMPK的激活;CA/CPR可促进自噬的激活，而二甲双胍预处理可进一步增强自噬的激活。
　　三、AMPK或自噬的抑制取消了二甲双胍在CA/CPR大鼠的神经保护作用，且AMPK的抑制减少了二甲双胍诱导的自噬激活，提示二甲双胍这种神经保护作用是通过AMPK诱导自噬激活介导的。

目录

摘要

二甲双胍在9分钟窒息性心脏骤停／心肺复苏模型的神经保护作用

1．1 前言

1．2 材料与方法

1．2．1 伦理学申明

1．2．2 实验动物

1．2．3 主要实验仪器和耗材

1．2．4 主要实验试剂

1．2．5 大鼠9分钟窒息性心脏骤停／心肺复苏(9-min ACA／CPR)模型的制备

1．2．6 动物的随机分组及给药方式

1．2．7 研究方案

1．2．8 神经功能评估

1．2．9 石蜡切片

1．2．10 尼氏染色

1．2．11 免疫组化染色

1．2．12 组织免疫荧光及共聚焦

1．2．13 Western Blot检测

1．2．14 侧脑室注射

1．2．15 透射电镜标本制作

1．2．16 大鼠血糖检测

1．2．17 统计学五}析

1．3 结果

1．3．1 各组基线特征及生理学参数的比较

1．3．2 二甲双胍预处理提高CA／CPR后大鼠的7天生存率

1．3．3 二甲双胍预处理改善CA／CPR后大鼠的神经功能缺损评分

1．3．4 二甲双胍预处理减少CA／CPR引起的海马CA1区神经元丢失

1．3．5 二甲双胍预处理减少CA／CPR引起的海马CA1区树突损伤

1．3．5 二甲双胍预处理抑制CA／CPR引起的海马CA1区胶质细胞活化

1．3．6 二甲双胍预处理减少CA／CPR引起的神经元凋亡

1．3．7 CA／CPR后，二甲双胍进一步诱导AMPK激活

1．3．8 抑制AMPK后，二申双胍对CA／CPR后大鼠的神经保护作用消失

1．3．9 CA／CPR造模后自噬水平升高

1．3．10 二甲双胍进一步促进CA／CPR诱导的自噬激活

1．3．11 自噬抑制剂氯喹可显著抑制二甲双胍的脑保护作用

1．3．12 AMPK抑制剂Compound C明显抑制二甲双胍对CA／CPR大鼠诱导的自噬激活

1．3．13 心脏骤停后的二甲双胍治疗可明显减少大鼠海马CAI区组织学损伤

1．4 讨论

1．5 结论

参考文献

攻读学位期间成果

主要缩略词中英文对照表

致谢

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