LASP2通过JNK/p38 MAPK信号通路介导的上皮间质转化抑制结直肠癌进展的相关研究

摘要

目的： 结直肠癌(colorectal cancer)是最常见的恶性肿瘤之一，其世界范围内的发病率和死亡率分别居肿瘤第三位和第四位，长期威胁着人类生命健康。近二十多年来，由于经济的快速发展及生活方式的西化，我国的结直肠癌发病率呈逐年上升趋势。虽然早期结直肠癌患者经过手术治疗，5年生存率高达90％以上，然而在我国临床上约40％的结直肠癌患者在确诊之初已出现微转移，而转移正是导致患者死亡的主要原因。结直肠癌严重降低患者的生活质量和生存期，同时也给患者和社会带来了沉重的经济负担。 本课题拟通过检测LASP2在结直肠癌中的表达情况，分析其表达与临床病理参数之间的相关性，并通过体外实验，研究LASP2在结直肠癌发生、发展和转移过程中的作用及相关分子机制。为临床结直肠癌的早期诊断分期及预后预测提供新的分子标志物。 方法： 一、LASP2在结直肠细胞及组织中的表达鉴定 1.提取结直肠癌细胞系mRNA及蛋白质，qPCR检测LASP2的mRNA相对表达量，Western blot检测LASP2蛋白表达量; 2.取89例临床确诊结直肠癌患者的手术切除组织蜡块以及72例正常结直肠粘膜上皮的蜡块，利用免疫组织化学(IHC)检测LASP2在其中的表达情况。 二、LASP2的表达定位与临床病理参数的相关性分析 利用Chi-square检验、Kaplan-Meier生存分析及多因素分析等统计方法分析LASP2的表达定位与肿瘤分期、转移及临床预后等相关临床病理参数之间的关系。 三、LASP2在结直肠癌增殖及转移过程中的作用 1.构建LASP2过表达载体，转染LASP2低表达结直肠癌细胞系，并利用Westernblot及qPCR鉴定过表达效果，通过CCK8、transwell实验检测转染后细胞的增殖及迁移能力; 2.合成siRNA干扰LASP2表达，转染LASP2高表达结直肠癌细胞系，鉴定干扰效果后利用CCK8、transwell实验检测干扰LASP2表达对结直肠癌细胞的增殖、迁移能力的影响。 四、LASP2调控结直肠癌增殖转移的分子机制 1.利用Western blot检测LASP2表达干扰后信号通路激活情况及EMT相关标志物的变化; 2.利用相关通路抑制剂证实LASP2通过特异性信号通路调控结直肠的增殖及转移。 五、LASP2与LASP1在结直肠癌中表达的相关性 1.利用qPCR检测LASP1、LASP2在结直肠癌细胞及组织中的表达; 2.通过转染LASP1的过表达载体及干扰siRNA，利用Western blot检测LASP1及LASP2的表达; 3.利用IHC检测在LASP1高表达及低表达病例中的LASP2表达情况。 结果： 一、LASP2在结直肠细胞及组织中的表达鉴定 1.结直肠癌细胞系中LASP2的表达 qPCR结果显示LASP2在人结直肠癌细胞株HT29、RKO、SW480中低表达，而在HCT116、SW620、SW480/M5中高表达，western blot也揭示了类似的结果，综合二者结果，我们选择SW480作为LASP2低表达细胞株，SW620及HCT116作为LASP2高表达细胞株进行后续实验。 2.结直肠癌组织中LASP2的表达 IHC结果表明LASP2在正常结直肠粘膜上皮中的过表达率为68％(49/72)，而在结直肠癌标本中的过表达率相对较低50.6％(45/89)(p=0.025)。 3.LASP2的表达和临床病理参数之间的关系 LASP2的表达水平与性别、年龄、肿瘤大小、T分期无显著性差异(p＞0.05);而与肿瘤的分化程度、淋巴结转移(N)、AJCC分期相关。分化程度越高，LASP2高表达率越高(p=0.023);N分期越高，LASP2高表达率越低(p=0.026);AJCC分期越晚，LASP2高表达率越低(p=0.015)。多因素分析显示LASP2过表达并不能作为预测患者预后的独立指标(p=0.177)，但单因素分析表明LASP2过表达同肿瘤分化程度、N分期一样，与结直肠癌患者预后密切相关(p=0.024)。 4.LASP2的表达和患者临床预后的相关性分析 Kaplan-Meier生存分析结果表明在所有89例结直肠癌患者中，LASP2高表达的患者生存率显著高于LASP2低表达的患者(log rank=5.490，p=0.019);在结直肠癌浸润深度分期T3及T4病例中，LASP2高表达患者的生存期同样显著高于LASP2低表达组（log rank=4.384，p=0.036）。 二、LASP2的表达对于结直肠癌细胞生物学特性的影响 1.LASP2载体瞬时转染过表达对结直肠癌细胞增殖及迁移的作用 1.1.LASP2瞬转过表达效率验证 利用阳离子脂质体法将LASP2质粒及空载分别转染SW480细胞，western blot结果表明LASP2质粒组显著过表达LASP2(p＜0.01)。 1.2.LASP2过表达对结直肠癌细胞增殖及迁移能力的影响 CCK8实验表明在SW480细胞中，LASP2质粒组的增殖速度低于空载组，时间与分组之间交互效应显著，差异具有统计学意义(p＜0.05)。结果说明LASP2过表达能够抑制结直肠癌细胞的增殖能力。Transwell实验结果显示在SW480细胞中，LASP2载体组的细胞迁移过tranwswell小室的数量明显少于空载组(p＜0.01)，说明LASP2过表达能够抑制结直肠癌细胞的迁移能力。 2.LASP2瞬时沉默对结直肠癌细胞增殖和迁移的影响 2.1.LASP2瞬时沉默的效率验证 选择前期已经验证干扰LASP2表达最有效的siRNA与对照片段分别瞬时转染HCTll6及SW620细胞，western blot实验显示LASP2干扰组低表达LASP2明显(p＜0.05)。 2.2.LASP2瞬时沉默对于结直肠癌细胞的增殖及迁移的作用 CCK8实验结果显示在HCT116和SW620细胞中，LASP2干扰组的生长速度高于对照组，生长时间与分组之间交互效应显著，差异具有统计学意义(p＜0.05)，结果说明干扰LASP2表达能够促进结直肠癌细胞的增殖。Transwell实验结果表明在HCT116和SW620细胞中，LASP2干扰组的细胞迁移过tranwswell小室的数量显著多于空载组(p＜0.01)，说明干扰LASP2表达能够促进结直肠癌细胞的迁移。 三、LASP2调控结直肠癌增殖转移的分子机制 1.干扰LASP2表达对JNK/p38MAPK信号通路的影响 将干扰LASP2表达的siRNA及对照组分别转染SW620细胞，western blot检测MAPK信号通路的相关蛋白表达，结果显示p38、SAPK/JNK、p44/42磷酸化水平显著提高，表明在结直肠癌细胞中LASP2的表达沉默后，JNK/p38MAPK信号通路激活。 2.干扰LASP2表达对EMT相关标志物的表达影响 Western blot检测SW620的LASP2干扰组及对照组中EMT相关分子标志物的表达情况，结果显示LASP2干扰组中上皮标志物(ZO-1、E-cadherin、β-catenin)的表达显著降低，而间叶标志物(N-cadherin、vimentin)表达显著升高，说明干扰结直肠癌细胞中的LASP2表达可诱导其发生EMT。 四、LASP2与LASP1在结直肠癌中的表达相关性 1.LASP2与LASP1在结直肠癌细胞系中的表达相关性 提取结直肠癌细胞系mRNA，qPCR同时检测LASP2和LASP1在其中的相对表达量，结果显示在LASP1高表达的细胞中LASP2低表达。同时选取SW480转染LASP1干扰siRNA，选取SW620转染LASP1过表达质粒，利用western blot检测LASP1和LASP2的相对表达量，结果显示干扰LASP1表达后，LASP2表达上调，反之过表达LASP1后LASP2表达下调。提示LASP1能够反向调节LASP2的表达。 2.LASP2与LASP1在结直肠癌组织中的表达相关性 89例结直肠癌标本的免疫组化结果显示在LASP1高表达的结直肠癌组织中LASP2低表达，反之在LASP1低表达的结直肠癌组织中LASP2高表达(R=-0.390，p=0.013)。 结论： LASP2在结直肠癌细胞系及组织中低表达，具有抑制结直肠癌细胞增殖及转移的能力，并且与结直肠癌患者的肿瘤分化程度、淋巴结转移(N)、AJCC分期以及临床预后等参数相关，是一个肿瘤患者分期及预后预测的潜在新型分子标志物。

目录

摘要

前言

第一章LASP2在结直肠癌细胞及组织中的表达鉴定

一、材料及方法

二、结果

三、结论

四、讨论

第二章LASP2的表达对于结直肠癌细胞生物学特性的影响

一、材料和方法

二、结果

三、结论

四、讨论

第三章LASP2调控结直肠癌增殖转移的分子机制

一、材料与方法

二、结果

三、结论

四、讨论

第四章LASP2与LASP1在结直肠癌中的表达相关性

一、材料与方法

二、结果

三、结论

四、讨论

全文小结

参考文献

缩写词简表

致谢

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