PAR1在内皮细胞凋亡及程序性坏死介导重症中暑急性肺损伤中的作用研究

摘要

目的：
　　重症中暑(Heatstroke)是危及人类生命的热相关性疾病，常合并多脏器功能不全。肺损伤是早期高发的并发症之一，主要表现为肺水肿、肺出血及呼吸衰竭。热打击可引起肺微血管内皮细胞(PMVECs)凋亡及程序性坏死，其是介导肺损伤的重要机制。蛋白酶激活受体1(Protease-activated receptor1，PAR1)是一种G蛋白偶联跨膜受体，是凝血酶激活进而导致炎症反应的主要受体。有研究显示，热打击后内皮细胞PAR1显著增加，引起血管内皮细胞通透性升高，从而导致小鼠肺损伤的发生，但其具体机制尚不明确。本研究选用C57BL/6小鼠及PMVECs，研究PAR1与下游信号NF-κB/c-Jun在热打击介导细胞凋亡中的作用及PAR1与下游RIP1/RIP3及MLKL/HMGB1在程序性坏死中的作用。
　　方法：
　　1.建立重症中暑小鼠模型，成年雄性C57BL/6小鼠置于39℃、65％湿度的高温仓内，核心体温(Tc)达到42.7℃造模成功，分室温正常对照组(NC);重症中暑组(HS);PAR1抗体预处理中暑组(anti-PAR1);PAR1抑制剂RWJ56110预处理重症中暑组(RWJ+HS)。与HS组比较，使用RWJ56110及PAR1抗体腹腔注射预处理小鼠可明显改善小鼠热耐受力。给予PAR1抑制剂RWJ56110预处理可明显延长重症中暑小鼠生存时间，改善生存率;可降低重症中暑小鼠血清中TNF-α、IL-6及HMGB1水平，减轻全身炎症反应，同时可降低肺泡灌洗液中白细胞计数、中性粒细胞计数、蛋白含量、肺水及干湿重比，从而改善肺损伤。
　　2.PMVECs给予43℃热打击90min（中度热打击），在恢复温度各时间点(0，2，6，12h)，Hoechst33342染色后，用荧光显微镜观察细胞凋亡情况、Western blotting检测Mcl-1、Bax、PAR1及c-Jun表达水平，ELISA检测Caspase-3及NF-κB活性，流式细胞仪分析细胞凋亡。
　　结果：
　　示随复温时间延长，PMVECs细胞凋亡数目明显增加，Mcl-1、Bax、c-Jun、p-c-Jun表达水平、Caspase-3活性明显增加。给予PAR1siRNA敲除PAR1及腺病毒过表达PAR1(Ad-PAR1)预处理细胞后，给予相同条件热打击，复温12h检测相关蛋白表达及细胞凋亡情况，经Ad-PAR1及PAR1激动剂TFLLR-NH2预处理的细胞，Mcl-1明显降低、Bax的表达及Caspase-3活性显著增加，凋亡数目增加;PAR1siRNA及PAR1抑制剂SCH79797预处理的细胞，Mcl-1明显增加、Bax的表达及Caspase-3活性显著下降，凋亡数目减少，同时还可使NF-κB DNA结合力增强，p-c-Jun和c-Jun的蛋白表达水平显著下降;使用c-Jun siRNA转染细胞，于热打击后复温12h检测细胞凋亡情况，敲除c-Jun后，细胞凋亡显著减少，c-Jun活化在热打击的PMVECs起着促凋亡作用，我们前期研究结果表明NF-κ3活化在热打击的PMVECs中起抗凋亡作用，综上所述，PAR1通过抑制NF-κB活化及增强c-Jun活化起着促凋亡作用。
　　3.建立重症中暑小鼠模型，复温2h，ELISA方法检测肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平。与对照组比较，给予PAR1抑制剂RWJ56110处理的小鼠，肺泡灌洗液中HMGB1及RIP3水平降低;肺组织中RIP1/RIP3复合物的形成减少。PMVECs给予43℃热打击3h（重度热打击），恢复期各个时间点(0，2，6，12h)检测到RIP1及MLKL蛋白表达水平显著升高;恢复期6h，坏死小体（RIP1/RIP3复合物）形成;RIP1抑制剂Nec-1、RIP1siRNA、RIP3siRNA及两者联合预处理可抑制PMVECs发生程序性坏死;给予PAR1抑制剂预处理，减轻热打击导致的HMGB1移位，减少细胞程序性坏死。
　　结论：
　　PAR1可能通过抑制NF-κB活化及激活c-Jun促进热打击PMVECs凋亡，并通过促进RIP1/RIP3复合物形成导致PMVECs程序性坏死，从而引起重症中暑急性肺损伤。

目录

摘要

前言

1．材料

2．重症中暑模型建立、实验分组及目的

3．实验方法

4．统计学方法

结果

第一部分 PAR1在热打击介导肺微血管内皮细胞凋亡中的作用

第二部分 PAR1介导肺微血管内皮细胞程序性坏死在重症中暑肺损伤中的作用

讨论

全文总结

综述

参考文献

中英文对照缩略词表

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