miR-497/Wnt3a/C-jun反馈环路调控神经胶质瘤细胞生长和上皮-间质转化的分子机制研究

摘要

胶质瘤是常见的神经系统恶性肿瘤，虽然神经外科手术，化学治疗和放射治疗相结合的治疗策略成为临床治疗胶质瘤的重要手段，但神经胶质瘤患者的预后和生存率仍然较差，其5年生存率低于5％。因此，阐明神经胶质瘤发生发展的分子机制以及进一步探究胶质瘤的治疗的新策略是对临床胶质瘤的治疗意义重大。
　　在过去的十年中，针对miRNA的研究一直是癌生物学领域热门研究内容之一。miRNA是长度为19-25个核苷酸的一类内源性非编码RNA。miRNA是细胞内信号通路重要的调控分子，主要通过与靶基因mRNA的3'非翻译区碱基互补配对并相互作用，从而影响靶mRNA分子的稳定性及翻译。这种mRNA干扰导致编码蛋白水平降低，从而影响一系列细胞过程，例如增殖，迁移和凋亡。有研究发现与相应的非肿瘤脑组织相比，部分miRNAs在恶性脑肿瘤中差异表达，这些miRNA发挥着靶向调控癌基因和抑制基因的功能，参与细胞迁移、细胞骨架重排、细胞侵袭侵袭性和血管生成的调控，从而阻断/促进肿瘤的发生发展。因此，miRNA可能在未来的肿瘤治疗中发挥巨大的作用，例如通过递送治疗性基因或微小RNA(miRNA)阻断肿瘤细胞增殖侵袭信号通路的重要靶标从而达到抑癌的目的。
　　miR-497是位于17号染色体短臂13.1(17p13.1)的miRNA，属于miR-15/16/195/424/497家族miRNA中的一员，该家族成员的成熟miRNAs5，端均包含了AGCAGC序列，并在人组织中均有中-高丰度的表达，是一簇高度保守的miRNA。有文献报道，抑癌基因P53等蛋白能够上调该家族miRNAs的表达，相反，应激和创伤下调它们的表达，另外其启动子甲基化和MYC也可引起它们的低表达，它们在细胞分裂、血管生成、代谢和应激反应等方面具有非常重要的作用。最近很多研究表明miR-497和miR-195所在染色体17p13.1的删除或拷贝数减少、等位基因缺失、启动子上游CpG岛区域发生异常高甲基化均可引起miR-497和miR-195表达下调，这两个miRNA与乳腺癌、原发性腹膜癌、黑色素瘤、结肠直肠癌等多种肿瘤、缺血性疾病和神经退行性疾病的发生密切相关。
　　miR-497在各种肿瘤中表达下调，如肝癌、非小细胞肺癌，原发性腹膜癌，胃癌和乳腺癌等，同时，miR-497在恶性肿瘤中发挥重要的抑癌基因的作用，miR-497的低表达可能促进了肿瘤的发生发展。在男性乳腺癌中，miR-497是表达下调最显的miRNA之一。DanLi等人的研究结果显示miR-195/497在乳腺癌组织中的表达水平与其恶性程度呈负相关。在乳腺癌中miR-497启动子区发生了异常CpG岛的高甲基化导致其表达下调。在乳腺癌细胞株MCF7以及ZR-75-30中通过过表达miR-497抑制其增殖和侵袭。miR-497通过靶向调控Raf-1和Ccnd1的表达抑制乳腺癌细胞的增殖和侵袭。研究发现miR-497在非小细胞肺癌组织和细胞株中表达下调，在肺癌细胞株中过表达miR-497显著抑制细胞增殖和集落形成，miR-497通过靶向调控HDGF的表达抑制非小细胞肺癌细胞的增殖。
　　在神经系统中，miR-497同样发挥着重要的功能。例如，miR-497能够通过靶向负调控抗凋亡蛋白bcl-2和bcl-w促进缺血性神经元的死亡。大鼠局灶性脑缺血后，敲除大鼠miR-497可有效增强缺血区bcl-2/-W蛋白水平，减弱缺血性脑梗塞。然而，miR-497在胶质瘤中的表达、对胶质瘤生物学行为的影响以及其潜在的分子机制仍有待进一步研究，阐明miR-497在胶质瘤发病机理中的作用具有较大的应用价值以及重要的科学意义。在本研究中，我们探讨了miR-497在胶质瘤细胞株及胶质瘤组织中的表达，miR-497在胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移过程中发挥的作用，并探讨了其潜在的作用机制。我们的研究发现在胶质瘤组织和细胞系中miR-497的表达显著下调。Wnt3a蛋白被鉴定为miR-497的下游靶标，并介导了miR-497在细胞生长和侵袭中所发挥的功能。此外，本研究还表明Wnt3a促进c-jun表达，从而负调控miR-497表达，总之，miR-497/Wnt3a/c-jun反馈环调控的失调是神经胶质瘤细胞异常生长增殖和发生上皮-间质转化的重要分子机制之一。
　　1.miR-497在胶质瘤组织和胶质瘤细胞株中表达下调
　　我们使用荧光实时定量PCR方法测定胶质瘤组织和正常脑组织中miR-497的表达情况。检测结果显示与正常脑组织相比，胶质瘤组织中miR-497的表达显著下调。同时，与正常脑细胞株NBC相比，胶质瘤细胞株中miR-497的表达显著下调。统计学分析发现miR-497表达高的胶质瘤患者无病生存率和总生存率显著高于miR-497低表达的患者。
　　2.Wnt3a是miR-497在胶质瘤中的直接靶点
　　来自miRNA数据库TargetScan和miRanda的生物信息学分析结果提示Wnt3a是miR-497重要靶标之一。为了检测miR-497能否通过直接靶向Wnt3a3'-UTR调控其表达，我们将Wnt3a的3'-UTR克隆到荧光素酶报告质粒中，其中包括预测的miR-497与Wnt3a的3'-UTR野生型结合位点(WT)荧光素酶报告质粒以及突变序列(MUT)荧光素酶报告质粒。与突变型miR-497质粒转染的U251细胞相比，用野生型质粒转染的细胞的荧光素酶活性显著降低。随后，通过RT-PCR和Western Blot检测，我们发现miR-497能够在mRNA和蛋白水平抑制Wnt3a的表达。进一步研究表明，胶质瘤组织中miR-497和Wnt3a之间表达呈负相关关系。
　　3.miR-497靶向Wnt3a在胶质瘤细胞中的作用
　　我们使用慢病毒作为载体过表达miR-497建立稳定表达miR-497的U251细胞株。用对照慢病毒载体(LV-ctrl)转导的细胞作为阴性对照。我们使用RT-PCR检测细胞的转染效率。正如预期的那样， MTT检测结果提示过表达miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。类似地，用LV-miR-497处理的U251细胞比用LV-ctrl处理的细胞形成更小和更少的集落。接下来我们检测miR-497是否可以控制细胞周期进程。我们观察到过表达miR-497能够明显降低S期细胞的比例并增加G1期细胞的比例。我们还检测了转染LV-miR-497细胞后细胞周期调控相关蛋白Cyclin D1，CDK4和E2F1的表达情况，发现过表达miR-497能够明显下调这些蛋白的表达。总之，上述实验结果提示miR-497能够通过调节细胞周期进程来减少神经胶质瘤细胞的生长。
　　随后，我们通过实验检测miR-497对胶质瘤细胞迁移的影响。Transwell检测结果提示过表达miR-497后能够明显抑制胶质瘤细胞的迁移。大量研究表明上皮-间质转化(EMT)在参与促进癌细胞迁移中发挥的重要作用，我们检测了miR-497对胶质瘤细胞株EMT的影响。在LV-miR-497细胞中E-cadherin表达升高，而N-cadherin和Vimentin表达下调。上述实验结果提示恢复miR-497的表达可能逆转EMT并下调胶质瘤细胞的迁移能力。接下来我们通过进一步实验以确定miR-497是否主要通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株迁移的功能。实验结果表明当Wnt3a过表达时，通过过表达miR-497抑制Wnt3a对胶质瘤细胞株侵袭转移的抑制作用被消除。此外，我们的研究结果还揭示了Wnt3a的过表达逆转了miR-497对细胞生长，细胞周期分布，侵袭和EMT表型变化的影响。总之，上述实验结果表明miR-497通过靶向Wnt3a抑制神经胶质瘤细胞生长和迁移。
　　4.Wnt3a通过c-jun负调控miR-497的表达
　　我们进一步探究了miR-497在胶质瘤中下调的潜在分子机制。首先，我们使用UCSC和PROMO生物信息学软件寻找到了miR-497转录起始位点上游1000个碱基的区域。进一步生物信息学分析结果提示miR-497转录起始位点上游-978至-972和-952至-946启动子区域存在两个潜在的c-jun转录因子结合位点。上述转录因子结合位点被命名为A和B。染色质免疫沉淀(ChIP)检测结果提示c-jun蛋白能够结合上miR-497启动子中上述两个转录因子结合位点。启动子区荧光素酶报告基因检测结果发现下调c-jun蛋白表达能够提高miR-497转录活性并上调miR-497表达。
　　有文献报导肿瘤细胞中Wnt3a能够上调c-jun的表达。我们通过进一步试验验证在胶质瘤细胞中Wnt3a能否通过c-jun调节miR-497的表达。首先，我们通过si-RNA下调Wnt3a表达，发现通过干扰Wnt3a的表达后能够下调c-jun同时增加miR-497表达。然而，当c-jun过表达时，在转染了si-Wnt3a的胶质瘤细胞株中发现miR-497表达升高。用质粒pcDNA-3.1-Wnt3a转染U251细胞后，发现过表达Wnt3a能够增加c-jun的表达水平，同时下调了miR-497的表达。然而，当c-jun表达被抑制时，在转染了pcDNA-3.1-Wnt3a的胶质瘤细胞中miR-497表达下调。总之，上述实验数据数据表明Wnt3a可能通过c-jun负调控miR-497的表达。
　　5.miR-497在体内抑制细胞生长
　　为了进一步确认miR-497能否在体内实验中抑制肿瘤的生长，我们分别将转染了LV-miR-497及LV-ctrl的胶质瘤细胞株U251注射到裸鼠的背部。与接种LV-ctrl细胞的异种移植肿瘤相比，接种LV-miR-497细胞株的裸鼠肿瘤生长得更缓慢。此外，接种LV-miR-497细胞的裸鼠体内异种移植肿瘤的平均重量显著低于接种LV-ctrl细胞的裸鼠。我们取下裸鼠体内的移植瘤进行固定脱水后石蜡包埋并进行切片，对肿瘤切片进行免疫组化增殖标记物Ki-67染色，结果表明miR-497在体内下调了胶质瘤细胞株的增殖速度。
　　研究表明一部分miRNAs有助于胶质瘤的发生发展和侵袭转移，并被认为是治疗胶质瘤的潜在新型治疗靶点。有研究报导了miR-497在癌症发生发展过程中所发挥的作用。在非小细胞肺癌中，miR-497表达下调，而过表达miR-497能够通过其靶向VEGF和YAP1抑制肿瘤细胞的生长和侵袭。在一系列的研究中发现了类似的结果，miR-497作为一种肿瘤抑癌基因发挥作用。研究表明microRNA-497的表达下调与胶质瘤患者的预后不良有关。然而，miR-497在神经胶质瘤中的生物学功能和潜在的分子机制目前尚不清楚。在本研究中，与之前文献所报道的结果一致，我们发现miR-497在胶质瘤组织和细胞系中表达下调。
　　在本研究中，Wnt3a被鉴定为miR-497下游的靶基因。我们提出miR-497可能通过靶向Wnt3a发挥其抑制胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的功能。为了进一步证实这一观点，我们在稳定转染miR-497的胶质瘤细胞株中过表达Wnt3a，观察到Wnt3a过表达逆转了miR-497对胶质瘤细胞株增殖及侵袭转移的抑制作用。在胶质瘤组织中我们也发现miR-497和Wnt3a的表达呈负相关。
　　随后，我们进行了细胞功能实验以探索miR-497在胶质瘤细胞中的作用。通过MTT和集落形成实验证实了miR-497能够抑制胶质瘤细胞的生长。随后我们检测了miR-497对胶质瘤细胞周期分布的影响，我们观察到过表达miR-497后胶质瘤细胞周期分布从G1期阻滞到S期。该数据表明miR-497可能通过影响细胞周期来下调胶质瘤细胞的生长能力。与体外研究一致，体内研究结果显示miR-497能够抑制裸鼠皮下移植瘤细胞的生长。
　　肿瘤侵袭转移是癌症发展进程的关键步骤之一。Boyden检测结果提示过表达miR-497能够下调胶质瘤细胞的侵袭转移能力。EMT与细胞侵袭能力密切相关，因此我们验证了miR-497对胶质瘤细胞株EMT表型的影响。如本研究Western Blot检测结果所示，在胶质瘤细胞株中过表达miR-497能够增加E-钙粘着蛋白表达，同时降低N-钙粘着蛋白和波形蛋白表达。上述实验结果提示miR-497可能通过抑制胶质瘤细胞株的上皮-间充质转化，最终下调神经胶质瘤细胞的侵袭转移能力。
　　最后，我们探究了导致胶质瘤miR-497失调的潜在分子机制。转录因子的异常调控通常会导致miRNA在遗传或表观遗传水平上的表达异常。在这些转录因子中，c-jun在肿瘤细胞生长和转移过程中发挥关键作用。通过生物信息学分析发现，在miR-497转录起始位点上游区域发现了c-jun的两个转录因子结合位点。ChIP-PCR和荧光素酶报告基因检测结果证实c-jun能够直接结合于miR-497启动子上并抑制其转录活性。实时荧光定量PCR检测结果显示c-jun能够负调控miR-497的表达。我们还证实了Wnt3a能够通过调节c-jun表达，从而控制miR-497的表达。我们的研究结果提示Wnt3a能够通过调控c-jun/miR-497轴促进胶质瘤细胞株的生长及侵袭转移。
　　总之，我们的研究结果提示Wnt3a/c-jun/miR-497反馈环调控神经胶质瘤细胞的生长和侵袭。miR-497的下调与胶质瘤患者的预后不良密切相关，并且恢复miR-497的表达降低了胶质瘤细胞株的生长和侵袭转移，所以靶向miR-497可能是神经胶质瘤的潜在治疗手段之一。

目录

摘要

前言

参考文献

技术路线

第一章 胶质瘤中miR-497表达特性的鉴定

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第二章 miR-497表达失调对胶质瘤细胞生物学特性的影响

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

第三章 miR-497／Wnt3a／c-jun反馈环在抑制胶质瘤细胞增殖及间充质转化的分子机理

一、材料与方法

二、结果

三、讨论

参考文献

攻读学位期间发表论文

英文缩写注解

全文小结

本课题创新之处

不足之处

致谢

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