间充质干细胞通过长链非编码RNA MACC1-AS1介导的脂肪酸氧化促进胃癌细胞干性和化疗抵抗

摘要

肿瘤干细胞(cancer stem cell，CSC)，是指具有干细胞(stem cell)性质的肿瘤细胞，又称肿瘤起始细胞(tumor initiating cell，TIC)，是一群处于静息或休眠状态、具有自我更新(self-renewal)和多向分化(multi-differentiation)能力的肿瘤细胞，被认为是肿瘤起始的重要因素，也是肿瘤复发过程中重建肿瘤的“种子细胞”。具有肿瘤干性(stemness)的肿瘤细胞即是肿瘤干细胞。肿瘤干性的增加是导致耐药的重要因素。
　　间充质干细胞(mesenchymal stem cell，MSC)是源于胚胎中胚层细胞的一种非造血成体干细胞，是肿瘤微环境中的重要组成部分。已知MSC在诱导化疗耐药中起着重要作用，其中重要的机制是MSC通过增加肿瘤细胞的干性从而诱导化疗耐药。然而，MSC促进肿瘤干性的机制尚不清楚。
　　脂肪酸是除了葡萄糖和谷氨酰胺外肿瘤细胞最重要的能量代谢底物。研究发现，脂肪酸氧化(fatty-acid oxidation，FAO)是肿瘤细胞获得能量的重要来源之一。已有研究证实，脂肪酸氧化可促进肿瘤细胞的干性;MSC可通过促进肿瘤细胞脂肪酸的分泌从而诱导化疗耐药。由此，我们猜想，MSC可能通过脂肪酸氧化促进肿瘤细胞的干性和化疗抵抗。
　　长链非编码RNA(long non-coding RNA，LncRNA)MACC1-AS1是通过基因测序新发现的结直肠癌相关转移基因1(metastasis-associated in colon cancer1，MACC1)的反义LncRNA。我们的前期预实验发现，MSC与胃癌细胞共培养后，胃癌细胞中的MACC1-AS1表达升高;MACC1-AS1可促进胃癌细胞脂肪酸氧化。据此，我们猜测，MACC1-AS1是否在MSC通过脂肪酸氧化促进胃癌细胞干性和化疗抵抗中发挥重要作用。
　　研究目的:
　　1.MSC可能促进胃癌细胞的干性和化疗抵抗;
　　2.脂肪酸氧化可能参与了MSC促进胃癌细胞干性和化疗抵抗的过程;
　　3.MACC1-AS1可能是介导MSC通过脂肪酸氧化促进胃癌细胞干性和化疗抵抗的重要分子。
　　研究方法:
　　1.MSC对胃癌细胞干性和化疗抵抗的影响
　　细胞水平，MSC与胃癌细胞共培养后，从RNA和蛋白水平验证胃癌细胞干性的相关标记分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28表达的改变;流式细胞术检测胃癌细胞干性标记分子CD44阳性细胞的比例;成球实验验证胃癌细胞成球能力的改变;用5-氟尿嘧啶(5-fluorouracil，5-FU)和奥沙利铂(oxaliplatin，OX)的条件培养基刺激胃癌细胞，观察胃癌细胞与MSC共培养后，克隆形成能力的改变。动物水平，通过有限稀释法(limiting dilution assay，LDA)构建裸鼠皮下移植瘤模型，将MSC与人源胃癌细胞以不同的比例接种于裸鼠皮下，通过检测其成瘤能力，明确MSC对胃癌起始能力的影响。
　　2.脂肪酸氧化对在MSC诱导的干性和化疗抵抗过程中发挥的作用
　　在明确MSC促进胃癌细胞干性的基础上，我们进一步研究脂肪酸氧化在这个过程中发挥的作用。MSC与胃癌细胞共培养后，从RNA和蛋白水平检测脂肪酸氧化相关蛋白乙酰辅酶A合成酶(acyl-CoA synthetase，ACS)和肉毒碱棕榈酰转移酶1(carnitine palmitoyltransferase1，CPT1)的表达改变;试剂盒检测胃癌细胞脂肪酸β氧化速率和ATP产生速率的改变;沉默脂肪酸β氧化的关键酶CPT1后，观察干性相关分子RNA和蛋白水平的改变、MTT实验检测不同浓度5-FU和OX对其药物敏感性的改变;回复实验验证脂肪酸氧化抑制剂乙莫克舍(etomoxir，ETX)逆转MSC对胃癌细胞干性和化疗抵抗的促进作用。
　　3.MACC1-AS1在MSC促进胃癌细胞干性和化疗抵抗中发挥的作用
　　MSC与胃癌细胞共培养后，检测胃癌细胞MACC1-AS1表达的改变;提取老鼠皮下瘤RNA，对比MSC与胃癌细胞共同注射组和单纯胃癌细胞注射组MACC1-AS1表达。构建稳定过表达MACC1-AS1的胃癌细胞株，与对照组相比，从PCR和蛋白水平验证胃癌细胞干性的相关标记分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28、CD44表达的改变;成球实验验证胃癌细胞成球能力的改变;用不同浓度5-FU和OX的条件培养基刺激胃癌细胞，MTT实验观察胃癌细胞药物敏感性的改变。
　　4.脂肪酸氧化对在MACC1-AS1促进干性和化疗抵抗过程中发挥的作用
　　过表达MACC1-AS1后，观察胃癌细胞脂肪酸β氧化相关酶ACS和CPT1的RNA和蛋白水平改变;试剂盒检测胃癌细胞脂肪酸β氧化速率和ATP产生速率的改变;回复实验，分别用实时定量聚合酶链反应(quantitative real-time polymerase chain reaction，q-PCR)及蛋白免疫印迹(western blotting)、成球实验、MTT验证加入脂肪酸代谢抑制剂ETX是否能逆转过表达MACC1-AS1对胃癌细胞干性相关分子、成球能力和化疗抵抗的促进作用。
　　5.MACC1-AS1通过脂肪酸氧化促进干性和化疗抵抗的机制
　　为了进一步挖掘MACC1-AS1通过脂肪酸氧化促进干性和化疗抵抗的机制，通过LncRNASNP数据库分析发现:MACC1-AS1具有miR-145-5p的结合靶点。为了验证两者之间的关系，在RNA水平检测过表达MACC1-AS1对miR-14-5p表达影响，接着，过表达miR-145-5p观察胃癌细胞干性和药物敏感性的改变;进一步利用回复实验，验证过表达miR-145-5p是否可逆转MACC1-AS1对干性相关分子的表达、成球能力、化疗药物敏感性的促进作用。
　　6.体内抑制脂肪酸氧化对MSC诱导的化疗化疗抵抗的影响
　　用胃癌细胞MKN45构建皮下瘤小鼠模型，分为4组:GC组、GC+FOLFOX组、GC+FOLFOX+MSC组、GC+FOLFOX+MSC+ETX组，观察抑制脂肪酸氧化后，是否可以降低MSC诱导的FOLFOX方案的抵抗作用;同时，对瘤体的进行石蜡包埋、切片、免疫组化染色，观察干性相关标记分子OCT4、脂肪酸氧化关键酶CPT1、增殖、凋亡的指标变化。
　　研究结果:
　　1.MSC促进胃癌细胞干性和化疗抵抗
　　把MSC与胃癌细胞共培养后，胃癌细胞干性的相关标记分子CD133、OCT4、SOX2、LIN28、CD44的RNA和蛋白水平表达升高、成球能力增加、对5-FU和OX的药物敏感性降低。动物水平，将MSC与人源胃癌细胞以不同的比例接种于裸鼠皮下，发现MSC可以增加小鼠的成瘤能力。
　　2.MSC通过脂肪酸氧化促进胃癌细胞干性和化疗抵抗
　　把MSC与胃癌细胞共培养后，胃癌细胞中脂肪酸氧化的相关酶的表达升高，脂肪酸β氧化速率和ATP产生速率增加;利用小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)技术干扰CPT1的表达后，胃癌细胞干性相关分子的表达降低，对5-FU和OX的药物敏感性升高。进一步地加入CPT1的抑制剂ETX后，可以逆转MSC对于胃癌细胞的干性和化疗抵抗作用。
　　3.MACC1-AS1介导MSC促进胃癌细胞干性和化疗抵抗
　　为了进一步检测MSC通过脂肪酸氧化促进胃癌细胞干性和化疗抵抗的机制，MSC与胃癌细胞共培养后，发现胃癌细胞MACC1-AS1表达升高;提取老鼠皮下瘤的RNA，与单纯注射胃癌细胞组相比，共同注射MSC与胃癌细胞组的MACC1-AS1表达升高。过表达MACC1-AS1可促进胃癌细胞干性的相关标记分子RNA和蛋白水平表达升高、成球能力增加、对5-FU和OX的药物敏感性降低。
　　4.MACC1-AS1通过脂肪酸氧化促进干性和化疗抵抗
　　过表达MACC1-AS1后，胃癌细胞中ACS和CPT1的表达升高，脂肪酸β氧化速率和ATP产生速率增加;加入脂肪酸氧化抑制剂ETX后，可以逆转MACC1-AS1对干性相关分子的表达、成球能力促进作用，使MACC1-AS1对5-FU和OX敏感性得到回复。
　　5.MACC1-AS1通过miR-145-5p调控脂肪酸氧化，从而促进干性和化疗抵抗
　　过表达miR-145-5p后，干性相关分子和脂肪酸氧化相关酶的表达降低、胃癌细胞对5-FU和OX的敏感性增加，ATP产生速率降低，提示miR-145-5p可以抑制胃癌干性和化疗抵抗。过表达MACC1-AS1后可抑制miR-145-5p表达，。过表达miR-145-5p可以逆转MACC1-AS1对脂肪酸氧化、干性和化疗抵抗的促进作用。
　　6.体内抑制脂肪酸氧化对MSC诱导的化疗抵抗的影响
　　腹腔注射脂肪酸氧化抑制剂ETX后，逆转了MSC导致的FOLFOX方案的敏感性的降低，瘤体切片免疫组化染色中，干性相关标记分子OCT4、脂肪酸氧化关键酶CPT1、增殖的标记分子ki-67也显著地降低，凋亡的指标cleaved caspased3变化。小鼠心、肝、脾、肺、肾的HE染色提示ETX对小鼠的重要脏器结构尚未发现有影响。
　　研究结论:
　　MSC通过上调胃癌细胞MACC1-AS1表达，增强脂肪酸氧化，从而促进胃癌细胞干性和化疗抵抗。

目录

摘要

第一章 MSC对胃癌细胞干性和化疗抵抗的影响

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第二章 脂肪酸氧化对在MSC诱导的干性和化疗抵抗过程中发挥的作用

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第三章 MACC1-AS1在MSC促进胃癌细胞干性和化疗抵抗中发挥的作用

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第四章 脂肪酸氧化对在MACC1-AS1促进干性和化疗抵抗过程中发挥的作用

一、前言

三、结果

四、讨论

五、结论

第五章 MACC1-AS1通过脂肪酸氧化促进干性和化疗抵抗的机制

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

第六章 体内抑制脂肪酸氧化对MSC诱导的化疗化疗抵抗的影响

一、前言

二、材料与方法

三、结果

四、讨论

五、结论

总结

参考文献

中英文缩略词对照表

攻读硕士学位期间的成果

致谢

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