垂体柄损伤后下丘脑神经发生规律、作用及机制研究

摘要

下丘脑或垂体功能紊乱常见于下丘脑及其临近区域病变或手术后出现。其中典型并发症之一是中枢性尿崩症(CDI)，其特征为水电解质、垂体后叶激素紊乱。尽管有不少维持内环境平衡的治疗方案，但患者仍处于严重内环境紊乱风险，可导致死亡或慢性进展的转归。在临床实践中发现，部分患者可在术后CDI中恢复。类似地，在垂体损伤所致的CDI的哺乳动物中也观察到此现象。然而，恢复的机制及规律仍未阐明。为了进一步研究，本研究首先建立了稳定的CDI大鼠模型，使用3D金属打印的损毁刀建立垂体柄电损毁模型(PEL)，并且对PEL术后进行为期28天的尿量、饮水量以及尿比重检测，发现整个尿崩趋势呈三相型，使用聚类分析将术后为四个阶段，急性尿崩期（术后第1天），暂时恢复期（第2-4天），迟发尿崩期（第5-17天），和尿崩恢复期（第18-28天）。同时提出了尿崩指数(CDI index)以标准化评估尿崩状况，通过CDI指数和各期血清AVP以及血浆Na+水平比较发现，PEL术后大鼠得以恢复。
　　为了探讨恢复的机制。PEL后使用溴脱氧尿苷(BrdU)标记。在视上核(SON)与室旁核（PVN）均发现新生细胞(BrdU+)，且不少新生细胞分化为GABA能和谷氨酸能中间神经元，也可化为胶质细胞和少突胶质细胞。新生中间神经元与大细胞神经元有接触，并且新生细胞加入了原有神经环路产生了功能。
　　对下丘脑连续切片染色发现，在下丘脑正中隆起处(ME)，术后短期便出现大量BrdU+细胞，并且这些新生细胞大部分是由Nestin+Nkx2.1+静态神经干细胞(qNSCs)转化为BrdU+Nestin+Nkx2.1+激活态神经干细胞(aNSCs)而来。使用逆转录病毒分别区域标记ME、SON、PVN，只有在PEL并标记于ME组，才会在SON和PVN内出现GFP+细胞，从而确认ME为PEL术后NSCs的起源位点。为了观察新生细胞的迁移路线，使用神经前体细胞迁移的指标(DCX)标记。术后位于ME区的新生迁移细胞从ME迁移到视上核漏斗部，并且跨过视束到达视上核前部以及PVN，对脑组织进行透明化处理后在多光子扫描下观察整个正中隆起迁移流(ME migratory stream，MMS)。
　　为了研究调控Nkx2.1+Nestin+细胞的神经发生对CDI影响，LHX2为Nkx2.1+细胞分化为神经元的重要调控因子。使用AAV-shLHX2抑制分化为神经元后CDI症状加重，CDI指数高，尿崩症状加重。同时发现新生细胞表达IGFI受体，通过上调或者下调神经发生（侧脑室予IGF1或Ara-C），术后的CDI症状随之改变。通过本研究，我们证实了大鼠垂体柄离断引起了三相型尿崩，其症状的恢复，是通过激活ME的qNSCs转化为aNSCs，迁移至SON与PVN并分化为谷氨酸能和GABA能中间神经元，并加入神经环路产生功能进行自我调节。同时证实了神经发生对垂体柄离断引起CDI的恢复起到重要作用。

目录

摘要

前言

缩略词

第一部分 鞍上垂体柄电损毁模型引起中枢性尿崩模型的大鼠模型的建立与预后评估

一、引言

二、材料和方法

1 实验材料、主要仪器及试剂

2 实验方法

二、结果

1 大鼠中枢性尿崩症的生物学特性

2 活体磁共振成像

3 AVP的免疫染色

三、讨论

四、小结

第二部分 评估垂体柄离断后视上核与室旁核出现的新生神经元

一、材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果

2 术后28天后新生细胞极少转化为大细胞神经元

3．手术一个月后新生细胞可分化为神经元、胶质细胞以及少突胶质细胞

4．部分新生神经元为中间神经元

5．新生的中间神经元与原有的大细胞神经元有神经接触

6．新生的细胞加入了原有的神经环路产生功能

三、讨论

四、小结

第三部分 垂体柄离断后新生神经元的起源位置与迁移流

一、材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

三、结果

1．术后短期下丘脑正中隆起区有大量新生细胞被激活

2．正中隆起的新生细胞大部分表达神经元干细胞的标记

3．在SON和PVN出现神经前体细胞的迁移标记物

4．逆转录病毒标记提示SON和PVN细胞起源于ME

5．新生神经前体细胞的迁移现象： (ME migratory stem cells track，MmST)

6．光学透明化观察DCX+的迁移路径

三、讨论

四、小结

第四部分 下丘脑神经发生在中枢性尿崩中起重要作用

一、材料和方法

1 实验材料

2 实验方法

二、结果

1．下调LHX2后SON和PVN转化新生神经元减少

2．下调LHX2加重中枢性尿崩的症状

3．新生细胞中表达IGF1受体

4．神经发生抑制剂(Ara-c)和促进剂(IGF-1)对神经发生的影响

5．调控神经发生对中枢性尿崩的影响

三、讨论

四、小结

全文总结

参考文献

攻读博士期间主要成果

致谢

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